2022 Fiscal Year Research-status Report

Role of Sestrin1 phosphorylation in resistance exercise induced muscle protein synthesis

Research Project

Project/Area Number	22K11620
Research Institution	Shigakkan University
Principal Investigator	村上太郎至学館大学, 健康科学部, 教授 (10252305)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	Sestrin1 / レジスタンス運動 / mTORC1
Outline of Annual Research Achievements	食事とレジスタンス運動は、日常生活で筋肉たんぱく質の合成を増大させる2大要因である。セストリンは、DNA傷害や低酸素などの細胞ストレスによって誘導されるたんぱく質として発見されたが、近年、たんぱく質合成における細胞内の栄養センサーであることが提案されている。申請者は、レジスタンス運動によって筋肉のたんぱく質合成が増大するときに、筋肉で発現しているセストリン1がリン酸化されることに気づいた。本年度の目標は、レジスタンス運動によって筋肉でリン酸化されるセストリン１のリン酸化部位を決定することであった。ラットの両脚の腓腹筋にFlag標識したセストリン1の発現ベクターをエレクトロポーレション法で導入し、強制発現させた。右脚の下肢にトルク測定器と経皮的電気刺激を組み合わせて、等尺性の筋収縮によるレジスタンス運動を負荷し、直後に腓腹筋を摘出した。腓腹筋の抽出液を作製し、抗Flag抗体結合ビーズを用いてFlag標識セストリン1を免疫沈降して精製した。得られたFlag標識セストリン1たんぱく質を電気泳動し、標的のバンドを切り出した。標的バンドをリン酸化プロテオーム解析し、2ヶ所のリン酸化部位を決定した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason レジスタンス運動によって筋肉でリン酸化されるセストリン１のリン酸化部位を決定することができたため。
Strategy for Future Research Activity	今年度の実験でセストリン1のリン酸化部位を決定することができたため、来年度以降に以下の2つの実験を実施する。1つ目は、セストリン1のリン酸化抗体を作製することである。レジスタンス運動によって筋肉のセストリン1の2ヶ所がリン酸化されることが明らかになったため、それぞれのリン酸化部位に特異的な抗リン酸化セストリン1抗体を作製する。2つ目は、リン酸化セストリン1の機能解析をすることである。セストリン1のリン酸化部位のアミノ酸残基をアスパラギン酸もしくはグルタミン酸に置換した発現ベクターを作製し、マウス筋肉細胞のC2C12細胞に導入して発現させる。得られる変異体は、擬似リン酸化変異たんぱく質である。セストリン1の擬似リン酸化によって、mTORC1が活性化されるか否かをS6K1と4E-BP1のリン酸化を指標にして明らかにする。たんぱく質の合成率が増大するか否かもSUnSET法で明らかにする。一方で、セストリンのリン酸化部位をアラニンに置換した変異体をC2C12細胞に強制発現させる。得られる変異体は、擬似脱リン酸化変異たんぱく質である。上述と同様の方法で、mTORC1の活性化が抑制されるか否かを明らかにする。
Causes of Carryover	今年度は、共同研究先のエレクトロポーレションを用いて発現ベクターをラットに導入できたため、その購入に当てる予定であった予算を次年度に使用することができるようになった。来年度以降に当該機器を購入するか、もしくは、ベクターの導入方法をAAVを用いる方法等に変更して、そのための試薬や器具等の購入等に充てる。