2022 Fiscal Year Research-status Report
免疫系培養細胞を用いたセクリトーム解析による新規生物活性物質の網羅的探索
| Project/Area Number |
22K11759
|
|---|
| Research Institution | Gunma Paz University |
|---|
Principal Investigator |
高橋 克典 群馬パース大学, 医療技術学部, 准教授 (90597551)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
久保原 禅 順天堂大学, 大学院スポーツ健康科学研究科, 教授 (00221937)
菊地 晴久 慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 教授 (90302166)
木村 鮎子 群馬パース大学, 医療技術学部, 講師 (50553616)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
|
| Keywords | セクリトーム解析 / 合成化合物 / サイトカイン / IL-2 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
免疫系培養細胞に種々の合成化合物を添加した際に変化する培養上清中の分泌蛋白量を網羅的に解析することを目的としたセクリトーム解析の基礎検討を行った。免疫系培養細胞としてT細胞系培養細胞であるJurat細胞を用い、合成化合物としては先行研究で既にIL-2抑制効果を有することが判明している合成化合物（Bu-DIF-3など）を用いた。
培養細胞を用いたセクリトーム解析を行う際は、培養液中のFBSを除去する必要があるが、通常、FBS freeの状態で細胞を長時間培養した場合、死細胞が増加してしまい培養液中に分泌された蛋白以外に細胞破壊に伴う漏出蛋白が出現してしまう。一方で、細胞生存率を確保するために、FBS freeでの培養時間を短縮した場合、分泌される蛋白量が不十分となり、質量分析装置の検出限界を下回ってしまう可能性がある。そこで我々は細胞生存率をある程度維持しながら分泌蛋白の量を確保できる条件を検討することにした。その結果、FBS freeの状態での培養時間が９時間の条件が最適であることを見出した。この条件で、IL-2抑制系の合成化合物を作用させて、セクリトーム解析を行ったところ、IL-2だけではなく、いくつかのサイトカイン蛋白の変動が確認できた。この基礎検討結果を踏まえて、本年度は培養細胞や合成化合物の種類を変化させて、新薬候補となる化合物のスクリーニングを行う予定である。
また、既にIL-2抑制効果が判明している化合物について、細胞内シグナル経路に対する化合物の影響をウエスタンブロット法により確認したところ、シグナル経路内において合成化合物のターゲットを含む可能性が高い領域が判明した。さらに、レポーター遺伝子アッセイによりウエスタンブロット解析の結果の整合性を確認したところ、矛盾しないことが判明した。これを踏まえて本年度は、合成化合物のターゲット蛋白を特定したいと考える。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度は、研究以外のエフォート（主に教育関係）が当初想定していたよりも高くなってしまい、研究に費やす時間の確保が困難な時期があったため、やや研究の進行が遅れている状態にある。
|
| Strategy for Future Research Activity |
昨年度の研究で、セクリトーム解析の基礎的検討がある程度終わったため、本年度は基礎検討の結果をもとに、まずは、各種サイトカイン蛋白の分泌量に対する合成化合物の影響を解析する予定である。そして、増減を認めたサイトカイン蛋白については、リアルタイムPCRによりmRNAレベルの解析を進める予定である。また、シグナル経路に対する合成化合物のターゲット探索についても、作用エリアがある程度推定できたため、ウエスタンブロット解析によりシグナル経路内での探索エリアを狭めていき、ターゲット蛋白を特定していく予定である。
|
| Causes of Carryover |
当該年度は研究代表者における研究活動以外のエフォート（主として教育活動）が想定以上に高くなり、当初予定していた研究計画を少し遅らせることとなった。それに伴い共同研究者の研究計画も遅れることとなり、研究費の使用額が少額となった。次年度は、研究活動のエフォートに重点を置く予定であり、それに伴い共同研究者の研究費使用額も増加すると考えられる。特に化合物合成費用、質量分析器の消耗品代などを中心に研究費を使用する予定である。
|
