2023 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of intestinal bacterial invasion into intestinal epithelial cells and inflammation induction by an aluminum-containing food additive alum
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22K11763
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
若林 あや子 日本医科大学, 医学部, 講師 (30328851)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
遠田 悦子 日本医科大学, 医学部, 教授 (00589327)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | 食品添加物 / ミョウバン / 抗生剤 / 小腸上皮細胞 / 細胞死 / ピロトーシス / IL-33 / 好酸球 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はこれまで食品添加物アンモニウムミョウバン(AAS)が、抗生剤(アンピシリン、ネオマイシン、バンコマイシン、メトロニダゾール)処置したマウスの小腸上皮細胞(IEC)で重度の細胞死を引き起こすことを見出した。さらにIECのRNAシークエンス(RNA-seq)により、AASはIl33とCasp11遺伝子発現を増強し、抗生剤はCasp6およびNlrp6遺伝子発現を増強することを明らかにした。またマウス小腸内容物とIECの16S rRNA-seqの結果、抗生剤非処置マウスの小腸ではムリバキュラ科などのグラム陰性共生細菌が優勢であったが、抗生剤処置ではこれら共生菌が著しく減少し、グラム陽性のバチルス科細菌が優勢であった。
そこで本年度マウスIECのウエスタンブロット解析を行ったところ、AAS経口投与したIECではIL-33、IL-18、カスパーゼ-1の切断・活性化が観察された。ただし活性型カスパーゼ-11と切断型ガスダーミンD (GSDMD)は、抗生剤処置下にAAS投与したIECでのみ検出された。加えて抗生剤処置IECでは活性型カスパーゼ-6が増加した。さらにマウス小腸組織のヘマトキシリン・エオジン染色と好酸球顆粒染色を行ったところ、抗生剤処置下にAAS投与した十二指腸・空腸・回腸における好酸球浸潤の増加、および回腸における絨毛萎縮が認められた。
これらの結果は、抗生剤処置下のIECではカスパーゼ6活性化によるアポトーシスが起こることに加えて、AASの経口投与によりカスパーゼ-1・カスパーゼ-11・GSDMDの切断を介したピロトーシスと成熟IL-18・IL-33の放出が誘発される可能性を示す。従って食品添加物ミョウバンは、抗生剤処置によりディスバイオーシスを起こした腸管で重篤な上皮細胞死、成熟IL-33とIL-18分泌、好酸球浸潤によるアレルギー性炎症を引き起こす可能性がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度、ウエスタンブロット解析により、AAS経口投与したIECではIL-33、IL-18、カスパーゼ-1が切断・活性化され、活性型カスパーゼ-11と切断型ガスダーミンD（GSDMD）は抗生剤処置下にAAS投与したIECでのみみられることが明らかになったことは大きな進展であった。加えて抗生剤処置下にAAS投与した十二指腸・空腸・回腸における好酸球浸潤の増加、および回腸における絨毛萎縮を観察したことも大変意義のある発見であった。
現在までの結果、抗生剤処置下のIECではAAS投与によりカスパーゼ-1、カスパーゼ-11、GSDMDの切断を介したピロトーシスと成熟IL-18・IL-33の放出が誘発され、腸管の好酸球浸潤を引き起こす可能性を示された。今年度の研究結果は、今後のさらなる研究の方向づけを明確にするものであった。引き続く世界的社会状況の影響により、一部の試薬や実験器具などの納入の遅延や入手困難となる事態はあったが、代わりとなる試薬や器具を使用するなどして対応した。研究はおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究結果から、抗生剤処置はグラム陰性共生細菌を著しく減少させ、グラム陽性の抗生剤耐性バチルス科細菌優位なdysbiosis を引き起こすこと、こうした状態でAASはカスパーゼ-1、カスパーゼ-11、GSDMDの切断を介したピロトーシスと成熟IL-18・IL-33の放出が誘発され、腸管の好酸球浸潤を引き起こす可能性を示された。
そこで今後は、カスパーゼ-1阻害剤およびカスパーゼ-11阻害剤を用いて、GSDMD切断を介したピロトーシス・IL-33とIL-18の放出・腸管好酸球浸潤が抑制されるか否かを検討する。具体的には抗生剤処置したマウスへのAAS経口投与前にカスパーゼ-1阻害剤またはカスパーゼ-11阻害剤を注入し、腸上皮細胞におけるカスパーゼ-1・カスパーゼ-11・GSDMD・IL-33・IL-18の切断の変化、血清中IL-33・IL-18値の低下、腸管好酸球浸潤の減少の観察を試みる。
加えて、SV40-T抗原遺伝子を導入したマウス不死化小腸上皮細胞に、in vitroで抗生剤・AAS・グラム陽性細菌成分リポテイコ酸・グラム陰性細菌成分リポポリサッカロイドを暴露させ、AASが腸上皮細胞のエンドサイトーシス機能不全・リソソーム機能不全を引き起こして、リポテイコ酸などグラム陽性細菌成分の細胞質への曝露を促すかを明らかにする。加えて、細胞質リポテイコ酸によるインフラマソーム活性化、炎症性細胞死ピロトーシスとIL-33・IL-18分泌誘導について解析し、ミョウバンによる腸上皮バリアの損傷と消化管アレルギーの発症における腸内細菌の関与を明らかにする。消化管アレルギーの予防・治療・緩和の礎となるべく、本研究を推進する所存である。
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| Causes of Carryover |
理由: 研究の過程において、一部の試薬などを当初予定したものから、製品内容やメーカーを変更するなどした。また飼育の都合上、マウスの購入匹数に変更が生じた。世界的な社会状況の変化の影響により、一部の試薬・キットや実験器具の入手の遅延・価格高騰などにより若干の変更が生じたこともある。こうしたいくつかの理由のため、若干の次年度使用額が生じた。
使用計画: 次年度はマウス生体およびSV40-T抗原遺伝子を導入したマウス不死化小腸上皮細胞を用いたウエスタンブロッティング、蛍光免疫染色、ELISA、免疫沈降法など多様な実験研究を計画している。次年度の研究には多くのマウス、試薬、実験器具等が必要であり、次年度使用となった研究費は有効に使う予定である。必要な器具や試薬を研究計画に沿って購入して適切に実験を進め、貴重な研究費を社会に還元すべく研究を推進する所存である。
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