成熟前および成熟後Mafaノックアウトによる膵β細胞成熟機構の解明

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K11802
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 宮崎 早月 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (60452439)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 転写因子 / 膵β細胞 / 成熟機構

Outline of Annual Research Achievements

Mafa KO-IT6マウスに発生したインスリノーマから樹立したMafa遺伝子欠損β細胞株（Mafa-KO-MIN6細胞）は、MIN6細胞と比較してMafb遺伝子を高発現し、コンパクトに盛り上がったコロニー形態を示した。この細胞株にレンチウイルスベクターをもちいてMafa発現を回復させたrescue細胞を作製した（Mafa-rescue-MIN6細胞）。一方、長期に安定な成熟β細胞株MIN6-CB4を樹立し、この細胞からCRISPR-Cas9システムを用いてMafa遺伝子の両方のアレルを欠損させたβ細胞株（CB4-Mafa-KO細胞）を作製した。さらにMafa発現をレンチウイルスベクターをもちいて回復させたrescue細胞（CB4-Mafa-rescue細胞）を作製した。CB4-Mafa-KO細胞およびCB4-Mafa-rescue細胞をもちいてグルコース応答性インスリン分泌（GSIS）などの解析を進めたところ、KO細胞ではGSISは非常に低下していたが、Mafa発現により、ほぼMIN6-CB4細胞と同程度のGSISに回復した。一方、いくつかのMafa-KO-MIN6細胞株とそのMafa-rescue-MIN6細胞株をもちいてGSISなどの解析を進めたところ、大まかに性質の異なる２群に分類されることが分かってきた。即ち、ほとんどGSISが回復しない群と、グルコース応答性は少し回復するものの高グルコース刺激に対するインスリン分泌量が非常に低い群である。何らかの影響で成熟段階が異なる可能性が考えられた。これらの細胞をもちいてRNA-seqを行い、遺伝子発現の変化を検討し、β細胞の成熟に必要な因子を探索した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

７群間（Mafa-KO-MIN6細胞（２クローン）、Mafa-rescue-MIN6細胞（２クローン）、MIN6-CB4細胞、CB4-Mafa-KO細胞、CB4-Mafa-rescue細胞）における遺伝子発現変化を解析し、β細胞の機能や成熟に関与すると推測される遺伝子・因子について順調に検討を進めている。

Strategy for Future Research Activity

MIN6細胞をdoxorubicinやH2O2で刺激すると、ストレスによって細胞の老化が誘導されSASP (Senescence-Associated Secretory Phenotype)が引き起こされることから、この方法にてCB4-Mafa-KO細胞の老化を誘導する。これまで解析してきたMafa-KO-MIN6細胞（２クローン）、Mafa-rescue-MIN6細胞（２クローン）、MIN6-CB4細胞、CB4-Mafa-KO細胞、CB4-Mafa-rescue細胞、さらには老化を誘導したCB4-Mafa-KO細胞を加えて、８群間におけるRNA-seq解析を行い、遺伝子発現の変化を総合的に検討する。これらの情報をもとにMafa遺伝子によって制御されるβ細胞の成熟や老化に関与すると推測される候補遺伝子・因子をリストアップし、それらのインスリン分泌能などへの影響を検討する。

Causes of Carryover

今年度計画していた老化を誘導したCB4-Mafa-KO細胞のRNA-seq解析などを来年度行うことにしたため。