2022 Fiscal Year Research-status Report
血中リン調節因子Galnt3、Fgf23遺伝子発現を制御するエンハンサーの同定
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22K11805
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Research Institution | Nagasaki University |
Principal Investigator |
坂根 千春 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医歯薬学総合研究系), 助教 (40792578)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小守 壽文 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (00252677)
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Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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Keywords | Runx2 / Galnt3 / Fgf23 / エンハンサー / 血中リン濃度制御 |
Outline of Annual Research Achievements |
この研究では、血中のリン濃度を調節しているホルモンFGF23(遺伝子名Fgf23)と、その活性を維持している酵素GalNAc-T3(遺伝子名Galnt3)の発現が、どのように制御されているかを調べる。FGF23は主に骨から産生され、骨形成に必須の転写因子Runx2を介して発現調節されている可能性がある。また、Runx2が転写調節する遺伝子をマイクロアレイで網羅的に検索した結果、Galnt3がRunx2によって骨芽細胞でも発現誘導された。このとき、Fgf23は骨芽細胞でも強く発現していた。したがって、Galnt3がFGF23の活性を維持する経路で、Runx2がGalnt3の発現を誘導し、血中リン濃度の調節に関与している可能性が考えられた。そこで、Runx2の結合領域を目印にエンハンサーを探索し、in vivo実験によってGalnt3およびFgf23の生理的発現に必要なエンハンサーを決定する。 はじめに、9週齢のマウス大腿骨および脛骨から分画した骨芽細胞画分と骨細胞画分を用いて、real-time RT-PCR法により、Runx2とGalnt3およびFgf23の発現を調べた。Runx2とGalnt3は骨芽細胞画分で強く発現しており、Fgf23は骨細胞画分で強く発現していた。つぎに、初代培養したマウス骨芽細胞を用いたRunx2抗体によるChIPシークエンスおよびATACシークエンスによるオープンクロマチン領域検出の結果と、データベース上の種間の塩基配列ホモロジーから、Galnt3のエンハンサー候補を選定した。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初代培養したSp7陽性マウス骨芽細胞を用いたRunx2抗体によるChIPシークエンスおよびATACシークエンスによるオープンクロマチン領域検出の結果と、データベース上の種間の塩基配列ホモロジーから、Galnt3のエンハンサー候補を選定した。Fgf23は骨芽細胞よりも骨細胞でより強く発現していた。初代培養した骨芽細胞を用いたChIPシークエンスおよびATACシークエンスからFgf23周辺の領域にピークが得られたが、これが生理的発現に必要なエンハンサーかどうかよく検討する。また、Runx2抗体によるChIPシークエンスのために骨細胞を集める方法を検討する。 選定したGalnt3のエンハンサー候補については、今後の研究の推進方策に記載した方法で検討していく。
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Strategy for Future Research Activity |
最小プロモーターを含むGFP発現ベクターにエンハンサー候補をそれぞれ挿入し、トランスジェニックマウスを作製する。3週齢で大腿骨の凍結切片を作製して蛍光顕微鏡観察によりGFP発現細胞を特定し、生理的発現パターンを再現できるエンハンサーを同定する。遺伝子工学試薬 、凍結組織切片作製用包埋剤等を購入する。マウス購入費とマウス維持費も必要となる。
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Causes of Carryover |
Runx2が転写調節する遺伝子をマイクロアレイで網羅的に検索した結果、Galnt3がRunx2によって骨芽細胞でも発現誘導された。このとき、Fgf23は骨芽細胞でも強く発現していた。 この結果をreal-time RT-PCR法で確認したため、また、Fgf23の発現が骨細胞でより強かったため、エンハンサー候補の選定が遅れた。 次年度に繰り越した研究費は、生理的発現パターンを再現できるエンハンサーを同定するため、遺伝子工学試薬、凍結組織切片作製用包埋剤等の購入、マウス購入費とマウス維持費に使用する。
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