2022 Fiscal Year Research-status Report
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22K11858
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
牛島 弘雅 岩手医科大学, 薬学部, 助教 (90509043)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 細胞老化 / 抗酸化活性 / necrostatin / necroptosis / ラジカル除去活性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、抗酸化作用を有する医薬品を用いて、老化細胞が正常（若い）細胞のような増殖機能を回復する医薬品をスクリーニングし、増殖能回復現象を分子生物学的手法により分析し、その分子機構に与る因子を明らかにすることを目指す。本研究は、「老化から正常細胞への機能回復」という観点から、加齢性疾患を克服する治療法を提供しうる研究である。これまでの予備検討により、抗酸化作用を有するイデベノンなどの薬物にそのような作用があることを見出している。
本年度は、スクリーニングする化合物数を増やし、新たな候補化合物としてnecrostatin誘導体を見出すことができた。necrostatin誘導体は、制御された細胞死の1つ形態であるnecroptosisを抑制する働きを有する化合物として知られており、その誘導体の1つであるNec-1sは、マウスの発毛促進作用があることも報告されている。これらnecrostatin誘導体の細胞死抑制作用は、その標的酵素であるRIPキナーゼの阻害作用によってRIPキナーゼの下流の細胞死シグナルが減衰することでもたらされると解釈されてきた。
今回我々は、RIPキナーゼ非依存の細胞死抑制機構として、化合物自身が有する抗酸化作用の強さに着目し、necrostatin誘導体及びapoptosis阻害薬などの細胞死抑制薬の抗酸化活性を評価した。その結果、Nec-1及びNec-1iの2つの化合物はスーパーオキシドアニオンに対するラジカル除去能を有することが示唆された。スーパーオキシドアニオンは活性酸素種の1つであり、細胞内での酸化ストレスの一因でもある。抗酸化作用によってこれらを直接的に除去することが、細胞死の抑制に寄与している可能性がある。引き続き、培養細胞を用いてこれら薬物の細胞増殖機能への影響を解析していく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究計画の当初の予定では、予備検討の段階で見出した化合物を対象として、細胞増殖能が回復した細胞から調製したRNAを用いて、本年度中にRNAシーケンシングを実行・解析する予定であった。しかしながら、継続して行っていた化合物スクリーニングによって新たに抗酸化作用を有する化合物をピックアップすることができたため、それら化合物の抗酸化能を評価する実験及び解析する時間が追加で必要となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
異なる濃度の薬剤作用させたIMR90及びIMR90-SCからtotal RNAを抽出し、RNAシーケンシング用のライブラリー調製を行う。コントロール群（薬剤未処理）の細胞から抽出したRNAについても同様に実験し、RNAシーケンシングを実行する。それらの結果を比較し、シーケンシングデータを解析する。シーケンシングデータの解析は、トリミングやゲノムへのマッピング、リードカウントデータの作成等、PCを用いて行う。RNA発現変動量の比較解析（DEGs: differentially expressed genes 解析）は、既存の統合解析環境を使用する（TCC-GUI,iDEP）。
次に、正常細胞及び老化細胞のシーケンスデータを比較し、薬剤処理群の老化細胞に特異的に発現変動が見られるシーケンスデータを集積する。細胞増殖能に関して既報があるものは優先して調査し、発現変動が見られた遺伝子から産生されるタンパク質間の相互作用の予測にはデータベース:STRING database (https://string-db.org/) を使用する。
候補分子がリストアップされた段階で、発現系及びノックダウン系の構築に着手する。まずは、老化細胞: IMR90-SCを対象にする予定であるが、細胞増殖回復シグナルが普遍性をもつか否かについては、細胞の種類を広げる必要がある。
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| Causes of Carryover |
当初予定していた実験計画よりも進捗がやや遅れており、使用する予定であった試薬（保存・使用期限アリ）の購入を控えたことにより差額が生じてしまった。翌年度の実験計画に合うように進捗状況を見直し適切に使用する予定である。
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