2023 Fiscal Year Research-status Report
微生物物質が促進する海藻栄養塩吸収に関わる鍵酵素群解明とその水圏環境浄化への利用
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22K12432
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
垣田 浩孝 日本大学, 文理学部, 教授 (40356754)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 海藻 / 水圏環境浄化 / 海洋資源 / 植物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
すでに報告者は環境浄化生物として有用な非成熟性オゴノリ科海藻を発見し、海藻成長促進微生物を単離し、微生物由来indole-3-acetic acid (IAA)と微生物が海藻成長と栄養塩吸収を促進することを見出した。さらにIAAと微生物による海藻の一部の代謝物質変動と一部の酵素量増加を見出した。本研究ではIAA等（微生物由来物質）により変動する海藻タンパク質を網羅的に解析し、海藻成長と栄養塩吸収能に関わる鍵酵素群を探索すると共に、窒素吸収特性、糖代謝特性を制御し、高成長と栄養塩高吸収機能を持つ海藻の調製に最適な培養条件を選定することを目的とする。
本研究初年度（令和4年度）に①糖は鍵酵素群の基質あるいは生成物と関連する生体物質であるが、ポストカラム蛍光誘導体化反応搭載HPLCによって、凍結乾燥海藻10 mgあれば遊離単糖類検出が可能であること、②ポリビニルピロリドン添加によりポリフェノールを分別でき、タンパク質回収率を上昇させること、③Tris-HCl緩衝液よりも尿素CHAPS抽出溶液での抽出の方がタンパク質の回収率が向上することを明らかにした。
本研究2年目（令和5年度）にIAA添加の有無がオゴノリ科海藻単藻培養株の成長率と栄養塩吸収量に及ぼす影響を評価した。IAA無添加区とIAA（0.64 mg/L）添加区を比較した。培養2週間目の成長率はIAA添加区の海藻の成長率がIAA無添加区の海藻の成長率より有意に高かった。硝酸態窒素及びアンモニア態窒素の吸収量は、IAA添加区の海藻の方がIAA無添加区の海藻よりも有意に高かった。次に、IAA無添加区で生育した海藻とIAA添加区で生育した海藻（それぞれn=3）よりRNAを抽出し、RNA-seqを行い、IAA添加の有無で発現量が大きく上昇または減少した遺伝子（発現変動遺伝子）を検出した。発現変動遺伝子の同定は次年度以降の課題である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実施期間を通じて、当該オゴノリ科海藻単藻培養株を培養環境が高精度制御可能な培養装置内で滅菌した人工海水中で継続培養し、実験に使用する。海水培地でのコンタミネーション（当該海藻以外が培養されてしまうこと。雑菌混入）の危険性を低減するために維持培養は複数の培養容器で行っている。今年度もコンタミネーションが起こらずに維持培養が継続でき、当該株由来の海藻切片を実験材料として使用できた。単藻培養株は藻類としてたった１種しか含まない状態になった培養株のことであり、実験材料としては個体差が少ない点等で優れている。
初年度目標『IAA添加条件の異なるオゴノリ科海藻単藻培養株のタンパク質の変動を電気泳動で分析する』のために、タンパク質可溶化の分画法としてポリフェノール除去法、水溶性タンパク質抽出法、膜結合タンパク質抽出法の大まかな条件を決めることができた（多糖の除去は未達成である）。酵素の基質や生成物に関連する遊離単糖の抽出条件と検出最低必要量も明らかにできている。これらの情報はタンパク質変動の解析をするために非常に重要な情報である。
本研究2年目にIAAの添加が海藻の成長率、硝酸態窒素吸収量、アンモニア態窒素吸収量を上昇させることを結果として得た。さらに、IAA無添加区で生育した海藻とIAA添加区で生育した海藻からRNAを抽出し、RNA-Seqを行い、IAA添加の有無で発現量が大きく上昇または減少する遺伝子（発現変動遺伝子）の存在が確認できた。このことは、IAAで活性化される代謝経路を明らかにする上で重要な情報である。また、海藻付着共存微生物を除去しない方が除去した場合よりも海藻成長が良いことを確認できた。
以上の成果が得られたことから区分(2)と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和6年度は引き続きオゴノリ科海藻保存株（単藻培養株）を本研究実施期間全般にわたって使用可能にするために維持培養を継続する。当該オゴノリ科海藻保存株のタンパク質含有量等の代謝変動への微生物由来物質等（IAA等）の特異的影響を明らかにするために他のオゴノリ科海藻培養株との比較実験が必要である。そのため、新規にオゴノリ科海藻オゴノリ株、ツルシラモ株等の単藻培養株を人工培養により実験に使用できる量まで培養して、海藻培養株のタンパク質含有量等の代謝変動への微生物由来物質等（IAA等）の影響を比較する。
IAA無添加区で生育した海藻とIAA添加区（あるいはIAAと海藻付着共存微生物添加区）で生育した海藻で生合成されるタンパク質の変動を電気泳動（2D-DIGE等）、LC-MS/MS等を用いて比較する。遺伝子に関しては、IAA無添加区で生育した海藻とIAA添加区（あるいはIAAと海藻付着共存微生物添加区）で生育した海藻のRNA-SeqデータとNCBIデータベースを活用し、IAA添加による発現変動遺伝子の同定を行う。発現変動遺伝子の同定はIAAあるいは海藻付着共存微生物添加で活性化される酵素タンパク質とその関与する代謝経路に関する情報に繋がる。
海藻からのタンパク質可溶化の分画に関してはこれまでに仮設定した分画条件をさらに細かく検討する。多糖の除去方法を検討する（特に処理温度）。酵素に関しては活性を持った酵素として発現しているか否かを判断する。酵素の基質や生成物に関してもLC (HPLC)、 GC-MSで定量する（基質や生成物は代謝経路中で消費される可能性があるが、海藻内の定常的な量を見積もる）。増殖海藻湿重量、栄養塩吸収量等の各測定を行う。
以上のことより、IAA添加あるいはIAAと微生物添加により活性化される酵素タンパク質と代謝経路に関する網羅的情報をもとに鍵酵素群を検討する。
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| Causes of Carryover |
見積もり予想額と見積額に差が生じたために次年度使用額が生じた。次年度使用となった額は、次年度の研究経費のうち消耗品費として有効に使用する計画である。次年度は、海藻株等の保存培養、酵素活性測定、海藻湿重量測定、栄養塩吸収量測定、海藻各種成分分析、海藻代謝物質の変動解析等を実施するために、次年度消耗品費により、試薬、化学実験器具、電気泳動消耗品、HPLC等の消耗品を購入し、実験を遂行する計画である。
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