2022 Fiscal Year Research-status Report
Development of a novel gene modification system for obligate anaerobes and its application to environmental measures
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22K12436
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| Research Institution | Beppu University |
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Principal Investigator |
陶山 明子 別府大学, 食物栄養科学部, 教授 (50721437)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | シャトルベクター / 宿主ベクター系 / 偏性嫌気性菌 / 難培養性 / 複製開始点 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本課題は、環境汚染物質であるテトラクロロエテン(PCE)を脱塩素化する偏性嫌気性細菌Desulfitobacterium hafniense Y51株を宿主として、難培養性偏性嫌気性細菌の機能未知タンパク質の機能解析や遺伝子発現を容易に行うことができる宿主ベクター系の開発を行うことを目的としている。
本年度は、まず、内在性プラスミドを持つ脱塩素化細菌の探索を実施した。Y51株および菌株保存機関等から入手可能な脱塩素化細菌およびそれ以外の嫌気性細菌について、内在性プラスミドの有無を調べ、内在性プラスミドの取得を試みた。
その結果、Y51株には内在性プラスミドは存在しなかった。その他の嫌気性細菌について文献検索し、Geobacter sulfurreducensで複製可能なプラスミドpCD354およびpBBR1、Lactobacillus helveticus由来プラスミドpLJ1、Desulfobacter hydrogenophilus由来の２種のプラスミド、Streptococcusと大腸菌のシャトルベクターpDL276、Lactococcus のシャトルベクターpTRKL2等が宿主ベクターの自己複製遺伝子領域に用いる候補として考えられた。
内在性プラスミドが取得できなかった場合の計画通り、ベクターの構築を実施した。まず、形質転換体条件を検討するために、以下の２種類の相同組換えベクターを構築した。一つは、選択マーカーとしてKanR遺伝子を用い、選択マーカー遺伝子のプロモーターとしてY51株由来のpceA遺伝子のプロモーターを、相同組換え領域としてpceA遺伝子の上流および下流の各約800 bpをpHSG299に導入した。もう一つはpceA遺伝子の代わりにfdrA遺伝子のプロモーターおよびfrdA遺伝子の上流および下流の約800 bpをpHSG299に導入した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
内在性プラスミドが取得できなかった場合の計画通り、文献等により嫌気性細菌のシャトルベクターを検索してY51株において自己複製可能な遺伝子領域の候補をピックアップするとともに、相同組換えベクターを構築した。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は、まず、本年度に作成した２種類の相同組換えベクターを使用して、エレクトロポレーションによる形質転換条件を確立する。電圧を10または12.5 kV/cm、抵抗値200、400、600、800 Ω等の組合せで検討する。選択圧として抗生物質（カナマイシン等）を使用する。形質転換体が得られない場合は、電圧および抵抗値の条件の変更、選択マーカー遺伝子のプロモーターの変更、選択マーカー遺伝子の変更、形質転換法の変更などを試みる。
並行して、文献およびデータベースから検索したプラスミドの自己複製に関与する遺伝子領域を合成またはクローニングし、大腸菌ベクターへ導入し、大腸菌－Y51株間のシャトルベクターを構築する。自己複製遺伝子領域は、Geobacter sulfurreducensで複製可能なプラスミドpCD354およびpBBR1、Lactobacillus helveticus由来プラスミドpLJ1、Desulfobacter hydrogenophilus由来プラスミド等、報告されているものを使用する。形質転換条件が確立できた後、構築したシャトルベクターを導入し、自己複製可能かどうか検討する。自己複製できなかった場合は、他の自己複製遺伝子領域を検討する。また、内在性プラスミドを持っているDesulfitobacteriumまたは近縁菌の単離を試みておく。
次に発現プロモーターの選抜を行う。Y51株のトランスクリプトーム解析結果から発現量の高いプロモーターを選抜し、その配列を導入することで大量発現用ベクターの構築を目指す。プロモーターの強さを測定するために、プロモーター下流にpceA(dehalogenase遺伝子)またはFAD結合蛍光タンパク質等を連結する。強く発現するプロモーターを構築したシャトルベクターに組込み、発現ベクターを構築する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が 3,974 円生じたが、これは年度末キャンペーンで割引率が高かったため予定よりも残金が生じたためである。翌年度分と合わせてプライマーの発注に使用する。
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