2023 Fiscal Year Research-status Report
Development of salivary gland cell culture platform to promote cell differentiation
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22K12825
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| Research Institution | Shigakkan University |
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Principal Investigator |
保住 建太郎 至学館大学, 健康科学部, 教授 (10453804)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2027-03-31
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| Keywords | ラミニン / 基底膜 / 細胞外マトリックス / 細胞接着 / ペプチド / キトサン / 合成ペプチド / 細胞培養基材 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
唾液腺や乳腺、腎臓などの器官発生プロセスでは、線維芽細胞をはじめとする間葉系細胞と、これらの細胞が分泌する細胞外マトリックスを主体とする間葉組織に、上皮系細胞が貫入していくことによって形成される。上皮系細胞貫入時の器官原基周囲は非常に薄い細胞外マトリックスである基底膜が形成される。基底膜の組成は発生の各ステージや組織によって異なる。基底膜の主要な構成成分で細胞外マトリックスタンパク質の一種であるラミニンは、基底膜タンパク質中で最も多くのアイソフォームを有していることから、基底膜の組成と機能の多様性はラミニンによっている可能性が高い。本研究計画はラミニンに注目し、腺組織原基の発生・分化に適した細胞外環境の基質特性を解明し、唾液腺細胞や各種幹細胞を始めとした細胞分化の誘導を可能とする細胞培養プラットフォームとしてのラミニン由来活性ペプチド-キトサンハイドロゲルの開発を目的としている。
令和五年度は本研究計画で得られた結果のうち、主に細胞培養プラットフォームの開発に関する研究で得られた成果を学会発表として報告した。ラミニン由来の細胞接着活性ペプチド・キトサン・ジカルボン酸を混合・架橋化することで作製するラミニン由来活性ペプチド-ジカルボン酸-キトサンハイドロゲルは、架橋化試薬としてDMTMMを用いるとワンポッドの簡易な操作で反応が進行することが可能となった。またキトサンハイドロゲルに固定化するラミニン由来ペプチドを特異的な受容体に結合する異なる細胞接着活性ペプチドとしたところ、固定化した活性ペプチドに応じてペプチドの特性を有する細胞培養プラットフォームとすることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和五年度は、当初の予定通り細胞培養プラットフォームの開発に関する研究とラミニンヘテロトライマー領域の組み換えタンパク質発現系の開発の研究に関して行った。
細胞培養プラットフォームの開発に関する研究では、ラミニン由来の細胞接着活性ペプチド・キトサン・ジカルボン酸を混合し架橋化反応を進行させ作成するラミニン由来活性ペプチド-ジカルボン酸-キトサンハイドロゲルは、架橋化試薬としてDMTMMを用いるとワンポッドの簡易な操作でのゲル化法開発に関する検証を主に行った。DMTMMによる架橋化には細胞接着活性ペプチド・キトサン・ジカルボン酸溶液のpH制御が非常に重要であることがわかり、水溶液のpHと架橋下の進行に関して五種類のジカルボン酸に関してそれぞれ架橋化が可能かつ、不溶性の沈殿物を生じないpHに関して最適化を行った。
ラミニンヘテロトライマー領域の組み換えタンパク質発現系の開発の研究に関しては、アルファ鎖、ベータ鎖、ガンマ鎖のヘテロトライマーそれぞれの発現タンパク質を異なるタグで精製・会合させることがキーポイントとなり、会合条件の解析には重要であると考えている。そこで、令和五年度は異なるタグを用いたラミニンヘテロトライマー領域の組み換えタンパク質発現の開発を行った。15種類あるうちの一つの組み合わせとなるアルファ1鎖、ベータ1鎖、ガンマ1鎖からなるラミニン-111のヘテロトライマー領域に関してはタンパク質の発現、会合を確認することができた。また、これらを別々に架橋したキトサンを作成し混合すると、キトサン同士を架橋化することなく、ヘテロトライマー領域-キトサンを混合するだけでキトサンが会合することが新たにわかった。
また、研究費に関しては、ほぼ計画通りに執行・利用した
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞外マトリックスは細胞-細胞外マトリックスだけでなく、細胞外マトリックス-細胞外マトリックス相互作用からなるゲル状構築物を形成する。このことから、培養プラットフォームの特性には、培養細胞から分泌される内因性細胞外マトリックス分子との相互作用も重用なファクターとして取り入れたほうが良い可能性は高い。本研究計画では、オルガノイド形成に伴って発生している基底膜中のラミニンのターンオーバーを解析し、得られた知見を活用することでオルガノイド培養プラットフォームとして最適化することを目的としている。計画の実行に向けて、「どのタイプのラミニンヘテロトライマー種が、どのような秩序で置換されているか」という問いを明らかにするために、1- ラミニンヘテロトライマー構造を認識する抗体を作製し、分泌ラミニンヘテロトライマーのアイソフォーム変遷を解明し、2-ラミニンヘテロトライマー結合ペプチド同定を目指して実施している。
１の目的達成に向けては、ラミニンヘテロトライマー部分の組み換えタンパク質を用意することができたため、令和６年度も引き続き抗体作成をすすめる。また、ヘテロトライマー領域を認識する抗体の選別にはモノマーおよびダイマーを認識する抗体は省く必要がある。そこで、選別用のモノマーとダイマーの作成をおこなっていく。
２の目的達成に向けては、ペプチドの化学合成がほぼ施設内で可能となったことから、昨年度から引き続きラミニンヘテロトライマーに結合する細胞外マトリックスタンパク質をラミニン由来合成ペプチドを利用することでスクリーニングする。逆にラミニン由来合成ペプチドに結合する細胞外マトリックスタンパク質に関しても検討を進めていく。
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| Causes of Carryover |
ほぼ計画通りに執行している
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