2022 Fiscal Year Research-status Report
小胞体標的マンノシダーゼ阻害剤の開発と細胞内糖鎖産生経路解析への応用
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22K14799
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| Research Institution | Seikei University |
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Principal Investigator |
栗原 大輝 成蹊大学, 理工学部, 助教 (70825372)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 糖鎖 / マンノシダーゼ阻害剤 / 高マンノース型糖鎖 / 糖鎖解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は独自の蛍光標識型高マンノース型糖鎖プローブをマウス肝臓から抽出した小胞体画分に添加して、小胞体マンノシダーゼ群の活性を追跡する系を確立してきた。また、in vitroにおいて上記活性を担う3種のマンノシダーゼに対してマンノシダーゼ阻害剤のスクリーニングを通して、2系統の小胞体マンノシダーゼに対する選択的阻害剤を見出した。これをマンノース切断経路解析に供して、別種の小胞体マンノシダーゼが担う独立した2つのマンノース切断経路の存在を示した。
本研究の目的は、これまでに見出したin vitroにおける独立した2つのマンノース切断経路の細胞内における存在の検証である。これを達成するために、1) 見出しているマンノシダーゼ阻害剤を細胞内解析ツールにすべく、小胞体標的能を付与した誘導体の合成を行う、2) 細胞内における小胞体糖鎖の静的、動的な糖鎖産生の解析手法を確立する、3) 1) および2) を組み合わせて細胞を用いて小胞体内糖鎖解析を行う。
本年度は要素技術となる1) および2) の項目に重点を置き研究を遂行した。1) では、小胞体標的マンノシダーゼ阻害剤の開発に向けて、母格となる阻害剤の大量供給を目指した。初期的な実験ではあるが大量供給可能な簡便な合成ルートの確立に成功している。また、小胞体標的マンノシダーゼ阻害剤の前駆体合成の経路を確立している段階にある。2) では、細胞内における小胞体糖鎖解析に必須な細胞からの小胞体抽出について検討した。既に細胞からの小胞体抽出法は確立していたが、取得できる小胞体量が少量でありかつ細胞種によって取得量にばらつきがあった。この問題に対して抽出法の改変および小胞体抽出に用いる細胞種の選定により、本研究の遂行により適した小胞体画分の抽出法を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
小胞体標的マンノシダーゼ阻害剤の前駆体合成経路の確立に成功した。また、糖鎖解析に必須な細胞由来小胞体画分の抽出法検討により細胞からの取得量の多い手法確立に成功した。これらの要素技術を確立しつつあるため、概ね順調に推移している。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度に確立した合成法を用いた小胞体標的マンノシダーゼ阻害剤の合成および改変型小胞体抽出法を用いて小胞体糖鎖の静的、動的な糖鎖解析法を確立する。特に静的な小胞体糖鎖解析においては、前年度に見出した手法により小胞体を抽出して、ヒドラジン分解あるいは糖鎖切断酵素PNGase Fにより小胞体糖タンパク質糖鎖を切り出しラベル化して解析する系を確立する。一方、動的な小胞体糖鎖解析においてはアジド標識タンパク質のパルスチェイス実験を経て経時的に小胞体内糖鎖を解析する系を確立する。
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| Causes of Carryover |
当初計画していた生化学実験試薬、細胞実験試薬の消耗を小胞体抽出法の改変により削減できたため。今後の方策を考慮して次年度に繰り越す方針とした。
本年度使用額と合算し、消耗品の支出に充てる。
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Research Products
(4 results)
