2022 Fiscal Year Research-status Report
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22K14815
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
青野 陸 立命館大学, 生命科学部, 助教 (80777938)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | セレンタンパク質 / アーキア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アーキアは細菌と同様に原核生物であるが、21番目のアミノ酸であるセレノシステイン (Sec) を含有するセレンタンパク質の合成機構は真核生物に近いと考えられている。Secは本来終止コドンであるUGAに挿入されることが知られており、その挿入にはmRNA上に存在し、ステムループ二次構造を形成するSec挿入配列 (SECIS) を必要とする。真核生物にはSECIS結合タンパク質eSBP2が存在し、Sec-tRNAを運搬するSelBはSECISに結合したeSBP2を認識することでポリペプチド中にSecを挿入する。しかし、真核生物のセレンタンパク質合成において鍵となるeSBP2はアーキアには存在せず、アーキアにおける詳細な合成機構は不明である。本研究ではアーキアにおけるセレンタンパク質合成機構の解明を目指して研究を行っている。
本研究の対象として、メタン生成アーキアMethanothermococcus okinawensisを選定した。eSBP2と同様に、アーキアにもSECISに結合してSelBを呼び込むaSBPが存在する可能性を考え、SelBと相互作用するタンパク質の探索を行った。まず大腸菌を用いてHis-tag付加組換え型SelBを調製した。調製した組換え型タンパク質と、M. okinawensisの細胞抽出液を用いてNiカラムによるプルダウンアッセイを行ったところ、SelBと同様の溶出パターンを示すaSBP候補タンパク質がいくつか観察された。また調製した組換え型タンパク質をもとに抗体を作製して免疫沈降を検討したところ、細胞抽出液中のSelBを補足することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までに、SelBと相互作用すると予想されるaSBPの探索に向けて、SelB組換え型タンパク質の調製に成功している。また当該組換え型タンパク質を用いたプルダウンアッセイにより、再現性の確認は必要であるが、M. okinawensisの細胞抽出液からSelBと相互作用する可能性のあるaSBP候補タンパク質を取得した。さらに組換え型SelBをもとに調製した抗体を用いて、細胞内SelBの補足に成功した。そのためSelBと相互作用するタンパク質を検出するには収量に課題があるが、共免疫沈降によるaSBP探索の基盤が構築できた。以上の成果を踏まえて、本年度はおおむね順調に進展していると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度までに引き続き、SelBと相互作用すると予想されるaSBPの探索を通じて、アーキアにおけるセレンタンパク質合成機構の解明を目指し、研究を行う。これまでに行ったプルダウンアッセイや共免疫沈降について、再現性の確認や実験系の改良を通じて、SelBと相互作用する候補タンパク質の取得・同定を目指す。加えて、バイオインフォマティクス解析によるセレンタンパク質を有するアーキアに特異的に存在する遺伝子の探索を通じたaSBPの探索も行う。また、セレンタンパク質合成系がセレン存在下において誘導される可能性を考え、セレン添加・非添加培地で培養した菌株に対して転写変動解析を行い、候補遺伝子探索を行う。さらに、上記検討により得られた候補遺伝子の機能解析に向けて、M. okinawensisの遺伝子組換え系の開発も検討する。
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| Causes of Carryover |
当該年度に島津製HPLCユニット (1,051,776円) を購入し、納品は年度内に行われたが、経理手続の都合上、支払いが次年度4月となったため、次年度使用額として計上した。
既に納品・支払いは完了しており、詳細な使用内容としては次年度に報告する。
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