ダイズ細胞内のイソフラボン配糖体の分解代謝機構の解明

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K14823
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 和氣 駿之 東北大学, 工学研究科, 助教 (10793705)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: フラボノイド / イソフラボン / 分解代謝 / ダイズ / 培養細胞

Outline of Annual Research Achievements

本研究は，ダイズ懸濁培養細胞（ECW1）におけるイソフラボノイド分解代謝機構を解明することを目的としている．本年度は，ECW１細胞内外のイソフラボノイド代謝応答を詳細に解析するため，エリシター処理としてYeast extract（YE）だけでなく，シクロデキストリン（CD）やメチルジャスモン酸を添加し，細胞内のイソフラボノイドおよび培地中に分泌されたイソフラボノイドをHPLCにより解析した．また，ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるスベロイルビスヒドロキサム酸（SBHA）を添加した際のイソフラボノイド代謝応答も解析した．HPLCによる代謝物解析の結果，5 mMのα-CDおよびγ-CDの添加および低濃度のSBHAの添加は細胞内外のイソフラボノイド組成に大きな影響を与えなかった．一方，これまでの解析と同様に，YEの添加は細胞内のイソフラボノイド蓄積量を急速に減少させることが示され，この時，細胞外へ分泌されるイソフラボノイド量はあまり変化しなかった．したがって，今回施した処理においてはYE処理時にのみ，イソフラボノイドの細胞内分解が生じていることが示唆された．YE処理後，1, 2, 5, 10, 24時間経過後の細胞をサンプリングし，RNA-seqによる解析を行った．発現変動遺伝子（DEG）の抽出を行い，イソフラボノイド代謝分解に寄与する候補遺伝子の探索を行った．DEGとしてイソフラボノイド合成酵素群が多数ピックアップされ，YE処理に応答したイソフラボノイド生合成増強に寄与する遺伝子が多数見出された．一方，分解に関与する遺伝子としてはβグルコシダーゼ（BULU）パラログが複数見出されたが，イソフラボノイドアグリコンの分解に関与する候補遺伝子はまだ見出されていない．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ダイズ懸濁培養細胞（ECW1）におけるYE，MJ，CD，SBHA添加の影響を再度詳細に解析した．HPLCによりイソフラボノイドの代謝変動を明らかにし，RNA-seqによりYE処理に応答した遺伝子発現プロファイルを明らかにした．多数のBGLUパラログの発現挙動を明らかにすることができ，イソフラボノイド分解に寄与する候補BGLUを選抜することができた．イソフラボノイドアグリコンの分解に関与する候補遺伝子は見出すことができなかった．

Strategy for Future Research Activity

BGLU候補遺伝子は，大腸菌組換え酵素を用いて速度論解析を行う．イソフラボンの分解酵素に関しては，酵素溶液におけるDaidzeinやフラボノイドの分解活性に種々に添加剤を加え，分解活性に与える影響を詳細に評価する．これにより，分解酵素のファミリーを推定し，DEGsリストと比較照合することで候補遺伝子を選抜する．

Causes of Carryover

細胞応答実験の再現性に問題があり，全体の進捗が遅れている．結果の論文化および学会発表を積極的に行い，また，n=3となるようにRNA-seqの繰り返し解析を行う．