2022 Fiscal Year Research-status Report
Development of novel psoralen conjugated triplex forming oligonucleotides and its application to a photo genome editing technology
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22K14839
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
三瓶 悠 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 助教 (70908540)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 1-位ソラレン導入型三重鎖形成核酸 / 三重鎖構造安定化 / 標的配列の拡張 / 二架橋体形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
デオキシリボース1-位ソラレン導入型三重鎖形成核酸（Ps-TFO）の機能評価を目的とし、下記の三項目について実施した。
1. 1-位ソラレン導入型デオキシリボースのアミダイト合成と核酸配列への導入：市販で入手可能なデオキシリボース誘導体を出発原料とし、10工程の合成反応を用いた構造変換により、1-位ソラレン導入型デオキシリボースのアミダイト化合物の合成に成功した。合成したアミダイトはホスホロアミダイト法によって核酸配列中へと導入し、目的とするPs-TFOの合成を達成した。
2. 合成したPs-TFOの三重鎖形成能評価：合成したリンカー長の異なる二種のアミダイトをそれぞれ導入したPs-TFOの三重鎖形成能評価をTm解析システムを用いて実施した。標的二重鎖のうち、片側一本鎖にプリン塩基を多く含有する配列でないと安定した三重鎖構造形成は不可能である。つまりこのプリン豊富な一本鎖中に含まれるピリミジン塩基部位（ミスマッチ部位）は三重鎖構造の不安定化を招く原因となる。一方、今回合成したPs-TFOのソラレン導入部位を、このミスマッチ部位に相当する位置に配置し、三重鎖を形成させた場合、ピリミジン塩基との相互作用と考えられるソラレンのインターカレーションにより、ソラレン非導入型のTFOよりも形成される三重鎖構造が優位に安定化されていることが分かった。この結果は、今回合成したPs-TFOにより、三重鎖の標的配列が拡張できる可能性を示唆するものである。
3. 合成したPs-TFOの架橋体形成能評価：合成したPs-TFOの標的二重鎖に対する架橋能を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により評価した。その結果、ピリミジン塩基（チミン、シトシン）と効率的に二架橋体形成することが分かり、不可逆的な三重鎖構造が形成できることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
一年度目の目標であった、デオキシリボース1位ソラレン導入型三重鎖形成核酸の合成を達成し、その機能評価を行うことができた。結果は望んでいたものであり、応用研究へ展開していけることが分かった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、主に下記三項目について重点的に推進する。
1.配列一般性の検討：今回合成を達成した1位ソラレン導入型三重鎖形成核酸（Ps-TFO）の標的核酸の配列一般性を検討する。
2.Ps-TFOゲノム編集効率の評価：三重鎖形成核酸はDNA二重鎖切断誘発能を有することが知られている。この性質を利用し、当研究室で構築した迅速ルシフェラーゼレポーターアッセイ系を用いて、今回合成したPs-TFOのゲノム編集効率を評価する。
3.遺伝子増幅型がん細胞を標的としたPs-TFOの抗がん作用の評価：一部のがん細胞では、特定の遺伝子のコピー数が増幅されることで、がん化が促進されている。この増幅された遺伝子を標的としたTFOが複数のDNA二重鎖切断を誘起することで細胞にストレスがかかり、がん細胞選択的にアポトーシスが誘導されることが知られている。今回合成したPs-TFOは通常のTFOよりも幅広い配列を標的にできることが示されたので、本Ps-TFOの遺伝子増幅型がん細胞に対するより選択的な配列を標的とした、抗がん剤としての可能性を探る。
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| Remarks |
Researchmap 三瓶悠
https://researchmap.jp/Yu-Mikame
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