2022 Fiscal Year Research-status Report
Structural and functional study for mitohocndrial large channel formation.
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22K15078
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
竹田 弘法 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (80816588)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究はミトコンドリアが正常に機能するために必要な巨大チャネルタンパク質複合体がどのような機能を果たしているのかを明らかにするために、クライオ電子顕微鏡を用いた構造生物学的アプローチによって、その立体構造を決定し、巨大チャネルタンパク質複合体の分子メカニズムを解明することを目的としている。
本年度は、巨大チャネルタンパク質をコードしたプラスミドを作成し、酵母細胞に導入することで、巨大チャネルタンパク質複合体の大量発現をおこなった。さらに、精製ミトコンドリアから界面活性剤で可溶化し、アフィニティー精製によって巨大チャネルタンパク質複合体の精製をおこなった。BN-PAGEおよびゲル濾過精製の結果、精製されたタンパク質が複合体を形成していることがわかった。続いて、クライオ電子顕微鏡を用いた構造解析では、非常に小さなタンパク質粒子が観察された。そのため、クライオ電子顕微鏡での観察、特にグリッド上でタンパク質複合体が解離していると考えられる。
さらに、3つの異なる巨大チャネルタンパク質複合体の精製に成功している。これらについても複合体として精製できているが、グリッド上で解離する可能性もある。まずは粒子が解離しない、すなわちグリッド上で適切なサイズの粒子が観察されるターゲットから優先的に構造解析を行う必要があると考えている。
来年度は、グリッド上でも安定的に複合体を形成することができる精製条件を探索する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の目標は、巨大チャネルタンパク質複合体を大量精製することであった。その目標については達成できたと考えている。一方で、クライオ電子顕微鏡による解析では、複合体が解離していることが明らかになった。構造解析のための試料調製が今後の課題であるが、本年度中に構造解析へと進めることができた。さらに、合計4種類の巨大チャネルタンパク質複合体の大量精製にも成功しており、これらの構造が明らかになれば、巨大チャネルタンパク質複合体の分子メカニズムをより詳細に明らかにすることが可能であると考えている。そのため、概ね順調に進んでいると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在構造解析に進めているターゲットについては、グリッド上での解離が問題となっている。大量精製自体はうまくいっているので、精製よりも、いかに複合体を固定化するかに焦点を当てる。そのための工夫として、グルタルアルデヒドやBS3といった架橋材による固定化、グラジエント超遠心による界面活性剤の置換などを予定している。また、そのほか3つのターゲットについては、順次クライオ電子顕微鏡による構造解析に進め、複合体の解離が起こっていないものから優先的に構造解析を行なっていく。
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| Causes of Carryover |
当初、タンパク質複合体の大量精製に大量の培地・界面活性剤・精製樹脂が必要であったが、タンパク質精製が順調に進んだため、未使用金額が生じた。そのため次年度は、クライオ電子顕微鏡による構造解析と、追加で他の3つの蛋白質複合体の精製に使用する予定である。
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