2022 Fiscal Year Research-status Report
蛍光イメージングによる時空間的なゲノムインプリンティング制御機構の解明
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22K15084
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
大石 裕晃 九州大学, 生体防御医学研究所, 助教 (70912434)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | RNA-seqFISH / インプリント遺伝子の転写動態 / 転写バースト |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゲノム刷り込み(ゲノムインプリンティング)領域における時空間的な転写制御機構の研究を行うために、該当領域の可視化のためのプローブ設計およびその予備検証を実施した。まず特定のゲノム領域を5kbの区画に分画し、その領域に対応する最適なDNA配列を抽出した。この分画に対して、最小で20個以上の配列が割り当てられたものを解析対象として採用した。次にこれらの区画ごとで区別するための読み取り配列を付加した。さらに対象領域の遺伝子の転写を可視化するためにイントロン領域に同様のプローブの設計を行なった。これらの配列を用いて、一分子FISH法によってプローブの有用性を検証した。結果として、マウスES細胞においてインプリントを受けるMeg3やH19が片アレルから発現していることを確認した。一方ですべての細胞が片アレルから発現しているわけではなく、両アレルや全く発現していない細胞も観察された。転写バーストによって遺伝子の活性と静止状態が動的に変化している可能性がある。今後は、標的領域のプローブを用いたゲノム相互作用を含む空間配置情報や生細胞を用いた動態解析を行なうことでインプリント遺伝子の転写動態制御機構に迫る予定である。さらにプローブの検出感度を向上させるために、短鎖ヘアピンDNAを用いたHCR FISH法をseqFISH法に応用したHCR seqFISH法を確立した。この方法を用いることでプローブ数を4分の1程度に減らすことが可能になった。対象領域の拡大や検出効率の向上が見込んでいる。また転写動態の派生研究において転写動態を正確かつ簡便に観察可能な技術を開発し、当該内容を2022年12月Nature communications誌に発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
プローブの設計、予備検証、検出感度向上と順調に進んでいる。一方で、アレルを区別するためのプローブ設計についての課題を解決するための手法が定まっていないため、seqFISHの実施に至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
最初の半期を目標にアレルを区別するための、手法確立を最優先課題として進めていく。解決策としては、一塩基多型を基準にプローブの位置を設定し、HCR seqFISHにて1プローブでアレル特異的にゲノム領域を可視化が可能かどうか検証を行う。さらにマウス系統特異的に発現する複数の遺伝子を対象としてその発現様式からアレルの同定を試みる予定である。解析に使用するための細胞はすでに樹立ずみであるため速やかに検証可能である。
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| Causes of Carryover |
該当年度に購入予定であったオリゴプールの発注を行わなかった。現在オリゴプールの設計が最終段階であるため今後該当予算の残額を使用し購入予定である。またオンライン学会への参加が主だったため旅費の使用に該当しなかった。今後は対面式の学会がメインになるため使用予定である。また解析や実験に必要な備品を中心に研究費を使用していく。
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