バクテリアコンデンシンMukB同士の会合を介した染色体凝縮機構

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K15086
• Research Institution: National Institute of Genetics
• Principal Investigator: 秋山 光市郎 国立遺伝学研究所, 遺伝形質研究系, 特任研究員 (10800675)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: バクテリアコンデンシン / MukBEF / 染色体 / 大腸菌 / 部位特異的光架橋

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、(A)一本鎖DNAに結合したMukBEF複合体によるDNA凝縮の検出、(B)一本鎖DNA結合後のMukBの構造状態の解析、の2つの実験を通して、一本鎖DNA領域に結合したMukBがDNAを凝縮する分子機構の解明を目指す。(A)(B)のいずれにおいても大腸菌の細胞を用いた実験と精製タンパク質を用いた生化学実験をそれぞれ実施し、in vivo とin vitroの両面からアプローチする。2022年度は特に(B)の実験を中心に研究を実施した。(B)の実験では、MukBによるDNA凝縮が「一本鎖DNA結合」→（MukBの構造変化）→「MukFとの相互作用」→「DNA凝縮」という過程を辿るという仮説を立て、一本鎖DNA結合の有無がMukBとMukFの相互作用に及ぼす影響を比較することでこれを検証する。
まず、MukBとMukFの相互作用及びMukBダイマーの分子内相互作用を検出し、それらの相互作用が一本鎖DNAの有無や一本鎖DNA結合を低下させるMukB変異によって変化する様子を調べることでMukBの構造状態を解析しようと試みた。相互作用の検出は、アミノ酸残基レベルの分解能でタンパク質間相互作用を検出可能な部位特異的光架橋法を採用した。部位特異的光架橋実験に必要なMukB変異体及びMukF変異体を作製し華僑実験を実施したが、目的としたタンパク質間相互作用の検出には至っていない。
また、一本鎖DNA結合によりMukBの構造が変化するという仮説は、一本鎖DNA結合が低下したMukB変異体の分子内サプレッサー変異解析が一つの根拠となっている。2022年度はサプレッサー解析の実施を継続し、この仮説の基盤をより確かなものとした。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

「(B)一本鎖DNA結合後のMukBの構造状態の解析」の達成に向けて、MukBダイマー内の相互作用及びMukBとMukFの相互作用を指標としてMukBの構造変化を評価することを試みた。相互作用の検出にはアミノ酸残基レベルの高い空間分解能がある部位特異的光架橋法を用いたが、現在のところ架橋産物の検出には至っていない。これまではMukB変異体或いはMukF変異体のいずれかのみをプラスミドから発現して実験を行なったが、MukBEFの相対的な細胞内蓄積量に偏りが生じたことが相互作用の検出を困難にした可能性がある。そこで今後はMukB、MukF、MukEの全てのタンパク質を同じプラスミドから発現させて相互作用解析を試みる。また、MukBは1486アミノ酸から成る大きなタンパク質であるが、想定しているMukBの構造変化部位はヘッドドメイン及びネックドメインである。ヘッドドメインとネックドメインのみを持つMukB変異体（MukB-HN）を用いることで、想定している構造変化をより感度良く検出できると考え、全長MukBの代わりにMukB-HNを用いて実験を行う準備を進めている。また、「一本鎖DNA結合によりMukBの構造状態が変化する」という仮説は一本鎖DNA結合能が低下したMukB変異体の分子内サプレッサー解析で得られた結果が一つの根拠となっている。2022年度はサプレッサー解析を継続して実施することで、本研究の基盤をより確かなものとした。

Strategy for Future Research Activity

(A)一本鎖DNAに結合したMukBEF複合体によるDNA凝縮の検出、に関しては、当初の計画通りに実験を実施する。(A)-1：一本鎖DNAまたは二本鎖DNAを結合した直径1 μmのビーズを準備し、精製したMukBタンパク質を加える。MukBによるDNAの凝縮をビーズ同士の近接として評価する。(A)-2：細胞内で一本鎖DNAが生じている領域としてrDNA領域に着目する。2つの異なるrDNA領域をtetO/TetR-GFP及びlacO/LacI-mCherryでそれぞれ標識し、MukBによるrDNA領域同士の近接を検出する。(A)-1による生化学実験と(A)-2による生細胞を用いた実験により、in vitro 及び in vivo 両面からMukBによるDNA凝縮の機構を明らかにする。
(B)に関しては、引き続きMukBダイマー内の相互作用及びMukBとMukFの相互作用の検出を試みる。その際、MukB2022年度の実験結果を踏まえて改良した実験系を用いる。これと並行して、光架橋法以外の手法でも相互作用解析を行う。具体的には、(a)システイン残基を導入した変異体を用いたジスルフィド架橋実験、(b)ケミカルクロスリンカーを用いたタンパク質架橋実験、に2通りの方法を実施する。

Causes of Carryover

次年度使用額が生じた理由は主に進捗がやや遅れていることによる。2022年度に実施した部位特異的架橋実験が計画当初の予想よりも難航し遅れている。順調に進んだ場合は、変異型タンパク質を生成するため、大スケールでの培養を実施予定であった。光架橋実験に用いるパラベンゾイルフェニルアラニンは高額な試薬であり、大量培養をする場合には十分な量を購入する必要がある。2023年度は実験系を改良することで遅れをとり戻すことを見込んでおり、そこで必要となる試薬を購入する。