2022 Fiscal Year Research-status Report
Characterizing the roles of oocyte-specific factors in inhibiting unique features of the sperm epigenome
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22K15125
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
白根 健次郎 大阪大学, 大学院医学系研究科, 講師 (50855004)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 卵母細胞 / 発生能獲得 / エピゲノム / 転写因子ネットワーク / 体外再構築系 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
雌雄の配偶子は異なるゲノム機能をもち、接合により相互補完されることにより発生能（全能性）を獲得する。本研究では、ゲノム機能制御の代表例である配偶子のエピゲノム（特にDNAメチル化）制御に着目する。具体的には、①卵母細胞エピゲノムの雄性化を抑制する卵母細胞因子の同定と②その因子の発現制御機構の解明を目指す。初年度は、①の達成を目指し、以下の2項目を実施した。（1）卵母細胞因子を欠損するマウスES細胞の作出とそのES細胞を起点とした卵母細胞の誘導（後述の卵巣の体外再構築系を利用）と（2）因子欠損型の卵母細胞における全ゲノムDNAメチル化地図の作成である。
（1）CRISPR/Cas9法により、卵母細胞因子の発現制御領域を欠損させたES細胞を作出した。このES細胞を起点として、エピブラスト様細胞を誘導したのちに、始原生殖細胞様の細胞へと分化させた。セルソーターにより分取した始原生殖細胞様の細胞を胎齢12.5日胚の卵巣体細胞と凝集させたのちに、気相液相培養を行い、体外で卵巣を構築した。この体外再構築卵巣から二次卵母細胞を採取し、定量PCR法により卵母細胞因子の発現消失を確認した。
（2）酵素反応をベースとするDNAメチル化解析手法のEM-seq（Enzymatic Methyl-seq）法を微量細胞へと最適化したのちに全ゲノムDNAメチル化解析に着手した。野生型、因子欠損型の二次卵母細胞からEM-seq法によりライブラリーを調製し、全ゲノムDNAメチル化地図を作成した。現在、欠損型においてDNAメチル化変化領域の抽出を進めている。
最後に、本研究で取り上げている生殖細胞の発生とエピゲノム動態の現状のまとめと展望についての総説を発表した（Shirane, 2022）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
卵母細胞因子を欠損するES細胞の作出とそのES細胞を起点とした卵母細胞への分化誘導実験、さらには卵母細胞の全ゲノムDNAメチル化解析は当初計画通り進捗した。
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| Strategy for Future Research Activity |
上述のDNAメチル化解析をさらに進め、卵母細胞因子の欠損により変化するDNAメチル化領域の特徴の抽出やそのヒストン修飾との関連を調べる。また、着目する卵母細胞因子の発現制御機構を明らかにするため、この因子の発現制御領域に直接結合する転写制御因子の同定を目指す。卵母細胞特異的に発現する複数の転写制御因子に着目し、実験条件の最適化ののちにそれらのCUT&RUNを実施する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じたのは、購入予定であったサイトカイン（実験試薬）が既存のものを使用できたためである。この試薬は本研究課題において頻回に使用する予定ではあるが、その活性を考慮し、本年度ではなく次年度に購入するのが、細胞培養実験にとってより望ましいと判断した。したがって、次年度に繰越した予算は本年度に計上していた本実験試薬の購入に充てる予定である。
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