2022 Fiscal Year Research-status Report
ゼニゴケ精子変態期のライブイメージング手法の確立と細胞内分解系の役割の解明
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22K15149
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| Research Institution | National Institute for Basic Biology |
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Principal Investigator |
南野 尚紀 基礎生物学研究所, 細胞動態研究部門, 特任助教 (20823256)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 精子 / イメージング / 膜交通 / ゼニゴケ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
コケ植物を含むいくつかの植物の系統は雄性配偶子として運動能をもつ精子を形成する。精子が形成されるまでの過程のうち精子変態と呼ばれる時期では、鞭毛の新規形成、オルガネラや細胞質基質の除去、膜成分の変化などの様々な細胞の変化が起こるが、その変化を制御する仕組みについては未解明な点が多い。本研究では、コケ植物タイ類に属するゼニゴケをモデルとして、精子変態期において活発化する細胞内分解系に注目し、細胞内分解系が精子変態期において果たす役割の解明を目指す。特に精子変態期のライブイメージング手法の確立と、細胞膜タンパク質の分解に関わる因子の解析を主軸として研究を進めている。精子変態期ライブイメージング手法の確立について、ガラスボトムディッシュ上での造精器の培養条件の検討および観察条件の検討を行った。また細胞膜、液胞、鞭毛、アクチンの動態を観察するための各種マーカーラインの作出を行った。更なる観察条件の検討と最適化を進めるとともに、作成したマーカーラインの観察を順次進めていく。細胞膜タンパク質の分解の過程ではたらくタンパク質複合体であるESCRT-IIIについて、精子変態期における局在観察や機能阻害実験を行った。その結果、ESCRT-IIIが関与する細胞内分解系が精子変態に重要な役割を果たすことを明らかにした。また他の細胞内分解系であるオートファジーの精子変態期への関与についても解析を行い、精子変態期において起こるゴルジ体、ミトコンドリア、プラスチドなどの様々なオルガネラの分解や動態に重要な役割を果たすことを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
精子変態期のライブイメージング手法の確立のために、取り出した造精器をガラスボトムディッシュ上で培養する条件の検討を行った。染色した核の形態変化を指標として発生段階の進行を観察した。ある培地条件において1～2日程度は生存していたが、核の形態変化はあまり観察できず、より長期間の培養が必要な可能性が考えられた。
ESCRT-IIIは細胞膜タンパク質を液胞膜へと分解する過程で、多胞体内腔の小胞形成においてはたらくタンパク質複合体である。ESCRT-IIIサブユニットの過剰発現によるESCRT-IIIの機能阻害実験を行い、精子変態への影響を調べた。その結果、成熟精子の形態や運動に著しい異常がみられ、分解される細胞膜タンパク質の動態にも影響がみられた。これらのことから、ESCRT-IIIが関わる細胞内分解系が精子変態に重要な役割を果たすことが示された。興味深いことに、ESCRT-IIIサブユニットのひとつについて、その細胞内局在を調べると、エンドソーム様のドット状のコンパートメントに加え、精子変態期の特定のステージにおいて核膜へと局在することを見出した。
精子変態期におけるオートファジーの寄与についても調べた。オートファジー欠損変異体ではゴルジ体やミトコンドリアの異常な蓄積がみられた。さらにプラスチドの動態にも影響がみられた。これらのことから、オートファジーは精子変態期において、様々なオルガネラの分解や動態に重要な役割を果たすことが示された。
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| Strategy for Future Research Activity |
精子変態期を観察するために、造精器のより長期間の培養が可能な条件の検討を行う。雄器托部分を残した切片の状態での培養や、バクテリアの増殖を抑制する薬剤の添付などを計画している。現在の条件でも短期間は生存していると考えられるため、これまでに作出した細胞膜、液胞、鞭毛、アクチンの動態観察のためのマーカーラインについて、ライブイメージング観察も同時に進めていく。
これまでの解析により、精子変態期で亢進される細胞膜タンパク質の分解は精子変態に重要であることを明らかにした。今後はその分解の選択性にも注目した解析を行うことを計画している。細胞膜成分の多くは精子変態の過程で分解される一方で、卵細胞から分泌される誘引物質を認識するレセプターなどは精子の細胞膜に存在するはずである。どのようにして分解されるべきタンパク質のみを選択的に分解しているのか、その仕組みについて調べる。成熟精子の細胞膜を構成するタンパク質を同定し、分解されるタンパク質との挙動を比較する。エンドサイトーシスにおける積荷タンパク質の選別に関わるアダプタータンパク質に注目し、精子変態で機能する分子を探索する。機能阻害実験などを行い、選択的な細胞膜タンパク質分解の精子変態における重要性を明らかにする。
精子変態期におけるESCRT-IIIの機能解析の過程で、ESCRT-IIIのサブユニットのひとつが精子変態期の特定のステージにおいて核膜に局在するという興味深い結果を得た。ESCRT-IIIが核膜上で果たす機能解明のために、ライブイメージング解析などからアプローチすることも計画している。
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| Causes of Carryover |
研究遂行の過程で、当初の見込みよりも使用額を抑えることができたため、その分が次年度使用額となった。またCOVID-19の影響を鑑み、参加を予定していた国際会議への参加を見送ったため、それに関わる経費が次年度使用額となった。次年度はゼニゴケの各種マーカーラインなどを多数観察することを計画しており、栽培環境の整備、観察に必要な消耗品類、分子生物学実験に関わる消耗品類の購入に助成金の多くを執行することを計画している。また、研究遂行の過程で新たに必要が生じた、ゼニゴケ精子細胞膜タンパク質同定のための質量分析などを行うための委託解析費用にも充てることを計画している。
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