2022 Fiscal Year Research-status Report
トランスジェニックから探るアブラムシ細胞内共生系の分子基盤
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22K15169
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| Research Institution | National Institute for Basic Biology |
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Principal Investigator |
依田 真一 基礎生物学研究所, 進化ゲノミクス研究室, 特任助教 (70897751)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | アブラムシ / 細胞内共生 / 遺伝子導入 / piggyBac |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度はエンドウヒゲナガアブラムシにおいてトランスジェニックシステムを確立するために、DNAベクター(piggyBacトランスポゾン) を用いた遺伝子導入法の構築を行った。まず、初期胚で高活性なプロモーター配列を特定するために、蛍光タンパク質上流にプロモーター候補配列を挿入したdonor plasmidを作製し、初期胚にインジェクションした。リアルタイムPCRによって蛍光タンパク質の発現を定量したところ、2種類のプロモーターが初期胚で高活性を示すことがわかった。遺伝子導入個体を作出するために、helperとして改変型piggyBacであるhyper-active piggyBac transposase (hyPBase) を用いてdonor plasmidと一緒に初期胚にインジェクションした。Helperはプラスミド、またはin vitro転写したmRNAとして供給した。その結果、未だ系統化には至っていないものの、発生途中で死亡したG0世代を解析したところ1.4%の割合でモザイク個体が含まれていることがわかった。さらにアブラムシに最適な蛍光タンパク質について検討したところ、アブラムシ卵は緑色の波長域で自家蛍光を発する一方、赤色の波長域では自家蛍光がほとんど見られないことがわかった。そのため、緑色のGFPよりも赤色のDsRedやmCherryなどの蛍光タンパク質の方が遺伝子導入のマーカー遺伝子として適していることが示唆された。アブラムシ卵の孵化率を上げるために、アブラムシ卵へのインジェクション技術についても改良を行った。具体的には、ガラスキャピラリー先端の研磨法と卵のホルマリン処理による防カビ法を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
幼虫の致死個体に1.4%の割合でモザイク個体が含まれていたものの、未だに遺伝子導入個体の系統化には至っていないため。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、piggyBacシステムをベースに卵へのインジェクションを行うとともに、遺伝子導入効率を上げるためにhelperとしてpiggyBacタンパク質を導入することも検討する。CRISPR-Cas9法を用いたノックイン法についても検討する。
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| Causes of Carryover |
（理由）原著論文の投稿を予定していたが、次年度に先送りとなってしまったため（校正費、論文掲載料の先送り）。
（使用計画）年度内に原著論文を投稿する。
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