血管新生における転写抑制因子Blimp1の機能解析

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K15359
• Research Institution: Kagawa Prefectural College of Health Sciences
• Principal Investigator: 新美 健太 香川県立保健医療大学, 保健医療学部, 講師 (40807509)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 血管新生 / 網膜 / 転写因子 / 血管内皮細胞 / マウス

Outline of Annual Research Achievements

令和5年度はBlimp1遺伝子の欠失により新生児マウス網膜の血管新生異常がみられる原因の探索を行った。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）においてBlimp1遺伝子をsiRNAトランスフェクションによりノックダウンしたときに最も発現上昇がみられた遺伝子はTFPI2であった。文献検索によると、これは血管新生を阻害する作用を有するプロテアーゼインヒビターであることが分かった。したがって『新生血管ではBlimp1がTFPI2の発現を抑制することにより血管新生能を維持している』という仮説を立てた。TFPI2遺伝子の発現変動は定量PCRで再現でき、かつウェスタンブロットによりタンパク質レベルでも同様の発現上昇を認めることが分かった。またHUVECの固定クロマチンに対して抗Blimp1抗体によりクロマチン免疫沈降を行ったところ、TFPI2プロモーターの共沈が見られたのでBlimp1が直接TFPI2の発現を抑制している可能性が示唆された。
次いでTFPI2のin vivo新生血管における発現パターンを調べるために抗TFPI2抗体により網膜血管網で免疫組織化学を行った。部分的に血管におけるTFPI2の発現を認めたものの全体的に血管外のシグナルが多くみられ、またBlimp1ノックアウトによる明らかな発現上昇は確認できなかった。TFPI2は細胞外に分泌されるタンパク質であるため、免疫組織化学ではTFPI2産生細胞を正確に捕捉出来なかった可能性がある。これを解決するためにTFPI2遺伝子に対するプローブを使ったfluorescence in situ hybridization法の実施を検討しており準備中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本来の予定ではin vivoにおけるTFPI2発現を確認してからTFPI2阻害によりBlimp1ノックアウトマウス表現型のレスキュー実験を行うつもりであった。しかしながらin vivoにおけるTFPI2発現分析が免疫組織化学では行えず、新たな実験系としてFISHを立ち上げる必要が生じたため遅れが生じた。

Strategy for Future Research Activity

令和6年度は主に以下のことを明らかにする研究を行う。
①網膜新生血管においてのBlimp1およびTFPI2の発現パターンの分析：免疫組織化学あるいはFISHを用いて様々な血管新生ステージにおけるBlimp1, TFPI2の発現パターンを解析する。
②Blimp1の細胞外基質分解能調整についての分析：TFPI2の機能としてMMP2, MMP9の活性化を妨げることで細胞外基質分解を抑制し血管新生を阻害するということが知られている。Blimp1ノックアウトがTFPI2の発現を促進するならば、それにより細胞外基質分解能が影響を受ける可能性が考えられる。これを検討する。
③TFPI2抑制によるBlimp1欠失フェノタイプのレスキュー：Blimp1のノックアウトによる血管新生異常が本当にTFPI2の発現亢進を介しているか確かめるために、Blimp1ノックアウトマウスの眼球内にTFPI2の中和抗体を投与し表現型が抑制されるか検討を行う。

Causes of Carryover

遠方への学会出張がなく旅費の支出がなかったため。