2022 Fiscal Year Research-status Report
マンソン裂頭条虫由来分子による抑制性レセプターの探索とMAPK経路抑制機序の解明
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22K15451
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
近藤 陽子 鳥取大学, 医学部, 助教 (50632973)
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2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | マンソン裂頭条虫 / ES産物 / P-ISF / 細胞外小胞 / micro RNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当研究室ではマンソン裂頭条虫のプレロセルコイド（幼虫）が分泌する免疫抑制因子に着目し、これまでに幼虫の分泌物（ES）がマウスマクロファージのLPS活性を抑制する事を明らかにし、ES中からマクロファージに対する免疫抑制作用を有する糖タンパク質（Plerocercoid-immunosuppressive factor : P-ISF）の精製に成功した。
本研究では、精製したP-ISFを用いたP-ISFの樹状細胞への影響の解析およびP-ISFのマクロファージにおける相互作用因子の探索を予定していたが、P-ISFの精製に使用していたレクチンカラムの製造中止により、P-ISFの供給法の変更を余儀なくされた。複数のタンパク質合成系を用いて組換えタンパク質の作製を試みたが、生理活性のあるP-ISF組換えタンパク質は合成できず、P-ISFの新たな精製法を確立することにした。
新たな精製法を模索する過程において、ES中に細胞外小胞（EVs）を発見し、EVsがマウスマクロファージにおいてLPS刺激による一酸化窒素の産生や炎症性サイトカインの発現に対する抑制作用を持つことが明らかになった。また、免疫抑制作用が明らかになっているP-ISFはES中のEVsではない画分に検出されたため、EVsの免疫抑制作用はP-ISFとは異なる独立した作用であり、ES中の新たな免疫抑制因子の同定に成功した。さらに、この責任因子を探索し、EVs中に含まれるmicro RNAが一部を担っている可能性を見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ESから精製したP-ISFを用いて樹状細胞に対する作用の解析およびP-ISFの相互作用分子の探索を計画していたが、これまでにP-ISFの精製に使用していたレクチンカラムの製造が中止になり、P-ISFの供給方法の見直しが必要となった。そのため、当初の計画になかったP-ISF組換えタンパク質の作製に取り組み、立体構造の構築に優れたShuffleT7大腸菌および4種の哺乳類細胞でのタンパク質合成を試みたが、生理活性のある組換えタンパク質は得られなかった。これによりP-ISFを用いた実験が滞っているが、精製の代替法を模索する過程で新たな免疫抑制因子の発見に成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
P-ISFの樹状細胞に対する作用の解析および相互作用分子の探索について、実験に使用するP-ISFの精製方法を変更する。コムギ胚芽タンパク合成系で作製したP-ISF組換えタンパク質は、生理活性は持たなかったが、マウスに免疫して得られた特異抗体は虫体由来のネイティブなP-ISFを認識することを確認したため、抗P-ISF特異抗体を用いた精製を検討している。現在、抗原となる組換えタンパク質をマウスに免疫して抗体を作製し、精製用のアフィニティーカラムの準備を進めている。
新年度は、P-ISFの新たな精製法を確立し、精製したP-ISFは樹状細胞に添加してプレインキュベートした後LPSで刺激した時の表面抗原の発現およびサイトカインの産生を解析することでP-ISFの樹状細胞への影響を明らかにする。また、P-ISFとマクロファージのライセートと混合して免疫沈降を行い、相互作用分子の探索を行う。
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| Causes of Carryover |
初年度行う予定だった樹状細胞の解析を次年度に行う事になったので次年度使用額が生じた。次年度の実験に加えて初年度行う予定であった樹状細胞の解析を加えるため、繰り越された差額分に関しては樹状細胞の解析に必要な試薬の購入に充てる。
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