グラム陰性菌外膜タンパク質の膜挿入機構の解明

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K15463
• Research Institution: Soka University
• Principal Investigator: 青木 英莉子 創価大学, 糖鎖生命システム融合研究所, 助教 (80822874)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2026-03-31
• Keywords: BAM複合体 / オートトランスポーター / グラム陰性菌 / 外膜タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

BAM複合体は主要構成要素であるBamAと４つのリポタンパク質であるBamB-Eで構成される。BamB-Eの機能を調べるために、主要構成要素であるBamAと各１要素(BamB-E)で構成される複合体または各１要素が欠損した複合体（機能解析用複合体）を細胞外で再構成することを計画した。そして、この再構成した機能解析用複合体に基質タンパク質（Hia: インフルエンザ菌由来アドへシン）を反応させることにより複合体の機能がどのように変化するかを観察する。そして得られた結果より各リポタンパク質の機能を明らかにすることを目的とした。上記のような機能解析用複合体を細胞外で再構成するために、各タンパク質の単離精製を試みた。そして、その精製したタンパク質を用いて機能解析用複合体を再構成することを計画した。主要構成要素であるBamAタンパク質を大腸菌で発現させて精製することは以前の研究により確立されている。BamB-Eタンパク質に関しては発現精製系を確立していない為、発現ベクターの作成・大腸菌での発現・タンパク質の精製を試みた。その結果、一部のタンパク質に関しては精製系が確立された。しかし全てのタンパク質の発現精製系は確立するに至らなかった。また、機能解析用複合体を得る別の方法として、各構成要素が欠損した大腸菌株から取得する事も考えられる。この実験を行うための予備実験として、大腸菌から単離されたBAM複合体を含む膜画分を使用して基質タンパク質（Hia)のアセンブリ追跡を行なった。その結果、Hiaのアセンブリ追跡は可能であった。今後はBamB-E欠損株から機能解析用複合体を含む膜画分を取得して、各タンパク質の機能を解析することも計画している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

令和４年度は、BamB-Eの発現と精製を行う予定であったが、一部のタンパク質の精製に想定より時間がかかった為に遅れが生じた。さらに、研究代表者の所属機関移動に伴う作業で想定より研究時間に減少が生じた為、やや遅れが生じた。

Strategy for Future Research Activity

各タンパク質の精製に時間がかかったこと、所属機関異動で使用できる実験設備が変わったこと、機能解析用複合体を発現する大腸菌（BAM複合体のリポタンパク質欠損株）を移動先所属が保持していること、大腸菌から単離した膜を使用してのBAM複合体基質タンパク質のアセンブリ追跡方法が確立されていることを鑑みるに、今後は大腸菌から単離された機能解析用の複合体を含む膜画分を使用してのHia基質タンパク質のアセンブリ観察を試みる。

Causes of Carryover

計画の遅れにより機能解析複合体の再構成実験が実施できなかった為、次年度使用額が生じた。
次年度は、大腸菌から膜画分として機能解析複合体を取得する実験を実施するために使用する。