2022 Fiscal Year Research-status Report
蚊組織におけるフラビウイルスの糖鎖修飾部位に対する選択メカニズムの解明
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22K15477
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| Research Institution | Rakuno Gakuen University |
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Principal Investigator |
内田 玲麻 酪農学園大学, 獣医学群, 准教授 (50756723)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 蚊媒介性フラビウイルス / エンベロープ / 糖鎖修飾 / Quasispecies / 選択 / 蚊由来株化細胞 / 不死化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目標は蚊体内で遺伝子学的に多様な状態（Quasispecies）で存在するフラビウイルスが、エンベロープの糖鎖修飾部位について、どのようなメカニズムで特定の遺伝子型が選択されていくか明らかにすることである。そのため、2022年度は1. デングウイルスおよびジカウイルスの感染性クローンの確立と2. 蚊の組織特異的細胞株樹立のための不死化プラスミドの構築を目指した。
1. デングウイルスおよびジカウイルスの感染性クローンの確立
前段階として、ウイルスと細胞の結合を評価するため、糖鎖修飾部位に変異やFLAGタグを加えたジカウイルスのVirus-like particles（VLPs）を構築した。また、Circular Polymerase Extension Reaction（CPER）法を用いた感染性クローン確立のため、逆転写PCRによる断片化したジカウイルス遺伝子の増幅とリンカー配列の増幅を行った。
2. 蚊の組織特異的細胞株樹立のための不死化プラスミドの構築
CMV、CAG、IE1、OpIE2プロモーターおよびGFP遺伝子を用い、蚊由来株化細胞（C6/36）でのプロモーター活性を評価した。またT2A配列およびネオマイシン耐性遺伝子を用い、G418存在下での恒常発現系の構築を目指した。その結果、CMVプロモーターとBGH pAの組み合わせで、400μg/mlのG418存在下、GFP遺伝子の恒常発現系が構築された。また前述のプラスミドを基にGFP遺伝子をヒト癌原遺伝子であるcMYCに置き換えた不死化プラスミドを構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2022年度の目標は1. 感染性クローンの確立および2. 蚊組織特異的細胞株樹立のための不死化プラスミドの構築であった。1についてはまだ感染性クローンの完成には至っていないが、VLPsのシステムが構築できたこと、および当初計画していたプラスミドベースのシステムからCPER法に変えたことで効率的に作業が進み、次年度には糖鎖修飾部位に変異を加えた感染性クローンが得られると期待される。また、2については当初の目標である不死化プラスミドを形にすることができた。以上を勘案し、計画に若干の遅れはあるものの概ね順調に進展していると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の最終目標は蚊体内でフラビウイルスが、エンベロープの糖鎖修飾部位について、どのようなメカニズムで特定の遺伝子型が選択されていくか明らかにすることであり、そのために2023年度は継続して1. 感染性クローンの構築と2. 不死化プラスミドを用いた蚊初代培養細胞の株化を試みる。1についてはCPER法を用い、これまで作成したフラグメントを繋げHEK293、C6/36細胞にトランスフェクションすることで感染性ウイルスを得る。併せて糖鎖修飾部位に変異を加えたVLPsを用い細胞結合アッセイを試みる。2についてはまず、ヒトスジシマカおよびネッタイシマカの幼虫を用い、初代培養細胞を作成し、前年度作成した不死化プラスミドにより株化を試みる。幼虫を用いた実験が成功した場合、成虫の中腸および唾液腺から株化細胞の樹立を試みる。併せて、cMYC遺伝子の蚊での機能評価のため、C6/36細胞を用いた恒常発現系を構築する。
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| Causes of Carryover |
一部の機器、試薬等は既に研究室にあったものを使用したり、一部は他研究者より譲渡されたものを使用したため、予定されていた予算全額は使用せず次年度使用額が生じた。繰り越した予算は今年度予算と併せ、主に物品費に使用する。
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