Polled In Vivo CRISPR-Cas9 Screening in iPSCs to generate immune-evasive iPSCs

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K15490
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 王 博 京都大学, iPS細胞研究所, 特定拠点助教 (80842765)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: HLA / iPS細胞 / NK細胞 / CRISPR-Cas9 / スクリーニングライブラリ

Outline of Annual Research Achievements

iPS細胞由来の細胞製品は他者に移植することができるため、免疫原性関連因子の編集が一般的な研究対象となっている。本研究は、in vivoでの免疫反応を制御する遺伝子を探索するため、Genome-wide genetic screenにおいて免疫反応に対する耐性を持つ遺伝子を探索することを目的としている。まず、MHC dKOヒトiPS細胞を用いて、NK細胞によるkilling pressure下でのスクリーニングを行う方向性を決定した。臨床グレードのiPSCから、B2M/CIITA dKO iPS細胞を作製し、次にdKO iPS細胞とNK細胞を6時間共培養し、NK細胞によるdKO iPS細胞の約95％のキリング条件を探索した。さらに、Lenti-virusを用いたHuman CRISPR-Cas9スクリーニングライブラリをdKO iPS細胞の一個細胞に平均的に1種類のgRNAを導入する条件も探索した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Feeder-freeのマウスiPS細胞の確立と維持培養が予定通りに進まず、代わりに現在はヒトiPS細胞を用いたin vitroスクリーニングを優先して実施している。

Strategy for Future Research Activity

ヒトMHC dKO iPS細胞にCRISPR-Cas9スクリーニングライブラリを導入し、NK細胞と共に培養した後、生き残ったiPS細胞を次世代シーケンシングで解析し、プールされたsgRNAの豊度と分布を同定する。陽性および陰性の遺伝子プロファイルは更に解析され、候補因子が同定される。同定された因子のsgRNAスクリーニングライブラリを再びスクリーニングを行い、因子の組み合わせによるNK細胞への回避効果の寄与度を調べる。上位5位の組み合わせについて、iPS細胞分化能を評価するため、teratomaの形成とT細胞への分化を試す。分化したT細胞を用いてNK細胞に対する回避能力を調べる。

Causes of Carryover

予定していた実験が遅延したため、試薬、消耗品、解析費用などが発生しなかったため。