アミノ酸輸送体LAT1依存的リン酸化シグナルにおけるチロシンリン酸化制御機構解明

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K15512
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 岡西 広樹 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (70792589)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: アミノ酸 / トランスポーター / チロシンリン酸化 / プロテオミクス

Outline of Annual Research Achievements

がん細胞では，細胞増殖等の調節に関わるタンパク質の翻訳後修飾リン酸化ネットワークの制御に異常が生じている．アミノ酸はこのリン酸化ネットワークを刺激するシグナル分子の一つとしての機能を持つ．がん細胞特異的アミノ酸トランスポーターLAT1は，がん特異的な細胞内環境形成に寄与するアミノ酸シグナル機構を構成しているものと考えられる．申請者はこれまで，固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー (IMAC) によるリン酸化濃縮法を用いたプロテオーム解析により，LAT1を起点としたリン酸化ネットワークを解明してきたが，この方法は主にセリン・スレオニンのリン酸化動態の広範な解明には非常に有用である一方で，悪性腫瘍の発生に深く関与する受容体型・非受容体型チロシンキナーゼが触媒するチロシンのリン酸化は微量なため同定が難しく，より特異的な方法が必要であった．前年度までで，非常に特異性の高い競合的LAT1阻害薬ナンブランラト (JPH203) により有意な抗腫瘍効果があるとすでに評価済みの胆道がん細胞株3種類(KKU-055, KKU-100, KKU-213) において，タンパク質チロシンリン酸化ネットワーク変動、およびグローバルリン酸化ネットワーク変動および発現タンパク質変動を詳細に明らかにした．これらの結果を統計学的抽出およびデータベース化し，統計学的に有意な発現変動分子群,およびリン酸化修飾変動分子群を分子ネットワーク解析ソフトIPAによって解析した．本年度では，抽出された重要なチロシン関連分子についてまずウェスタンブロットでの確認を実施し，なかでもがんの増殖に重要なIGF-1R分子の顕著な動態を明らかにした．さらに，LAT1阻害条件でのIGF-1R分子の制御機構を明らかにするために共免疫沈降法を用いた相互作用タンパク質解析を実施した．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

前年度までにプロテオミクス的手法によって明らかにしたLAT1阻害薬ナンブランラト処理条件における胆道がんチロシンリン酸化動態データベースにおいて，Bioinfomaticsにより重要と目される分子の選定と確認を行った．さらに，抽出された重要なチロシン関連分子についてまず生化学的／細胞生物学的に検証を行い，LAT1阻害条件でより詳細な動態を明らかにした．特にがんの増殖などの重要な働きを示すIGF-1R分子に着目したうえで，LAT1阻害条件での制御機構の手がかりを得るための方法として，共免疫沈降法と質量分析法を組み合わせた系を確立した．現状は制御にかかわる可能性のある相互作用タンパク質について研究を進めている．これらは今年度に実施することを目標としていた研究内容であり，現在までの研究の進捗状況はおおむね順調に進展しているものと判断できる．

Strategy for Future Research Activity

LAT1阻害薬ナンブランラト処理条件において，胆道がんチロシンリン酸化プロテオミクスデータベースから抽出された重要なチロシン関連分子である，受容体型チロシンキナーゼIGF-1R分子が明らかになった．本年度では，共免疫沈降法と質量分析計を組み合わせた系により相互作用タンパク質を明らかにし，制御機構について手がかりを得た．ただ，この方法は弱い相互作用が明らかにできない問題があり，LAT1阻害条件でのIGF-1Rに対する相互作用変動の全容を解明できていない可能性がある．
そこで今後の研究推進として，標的分子の近傍タンパク質を標識可能なBioID 法を用いることを検討している．これは，BioID法による相互作用タンパク質群同定・定量系の確立，実施を試みるものである．また，この系によって明らかにされた相互作用タンパク質の役割についても明らかにする予定である．
さらに，IGF-1R動態が細胞におよぼす影響について，IGF-1R阻害薬などを用いて評価を行う予定である．

Causes of Carryover

実施予定の研究のうち，購入物品が必要なもので当該年度に実施が間に合わなかったものがあるため．いずれも次年度に購入予定である．