2022 Fiscal Year Research-status Report
GPCR間相互作用に基づくmGluR1のアミロイドβオリゴマー毒性拮抗作用の解明
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22K15653
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
坂入 伯駿 順天堂大学, 医学部, 助教 (20876693)
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2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 異種GPCR間相互作用 / アルツハイマー病 / シナプス毒性 / 代謝型グルタミン酸受容体(mGluR) / GABA-B受容体(GBR) |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アルツハイマー病におけるシナプス毒性ににおいて、可溶性アミロイドβオリゴマー(Aβo)と正常プリオンタンパク質(PrPC)の複合体が関与するとされている。Aβo-PrPC複合体は、5型代謝型グルタミン酸受容体(mGluR5)との結合により細胞内にシグナルを伝達し、シナプスの消失等のシナプス毒性を発揮する。一方、mGluR5と相同性の高い1型代謝型グルタミン酸受容体(mGluR1)は、同じくAβo- PrPC複合体と結合するにも関わらず寧ろシナプス毒性に拮抗する作用を示す。相同性の高いmGluR1とmGluR5でなぜこのような違いがあるのか、そのメカニズムは未解明である。申請者は、mGluR1がGABA-B受容体(GBR)と結合し、GBRのシグナルを弱めることを報告しており、またmGluR5はGBRとの結合能をもたないことを見出した。GBRの抑制はアルツハイマー病において記憶障害の改善に作用する報告があり、この作用に基づく治験も行われている。これらを踏まえ、本研究では「mGluR1はGBRとの結合を介したGBRシグナル抑制作用によりシナプス毒性に拮抗する」と仮説を立て、mGluR1とmGluR5のGBRに対する結合能の差異を基点として両者のシナプス毒性の違いを解明することを目的としている。本年度は、受容体間の結合能やシグナル調節について詳細な検討を可能にするため、GBR恒常発現HEK細胞、GBR恒常発現mGluR1誘導発現HEK細胞、及びGBR恒常発現mGluR5誘導発現HEK細胞を作成した。これらの細胞を用いて、GBRに対するmGluR1の結合能やシグナル調節をmGluR5と比較する形で解析を進めている。また今回作成したHEK細胞株により、これまで導入が困難であった1分子レベルでの局在評価技術の導入が可能となり、現在条件を検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究において受容体間の結合能やシグナル調節の詳細に検討するためには、各受容体を発現する新たなモデル細胞株の作成が必要と判断した。そのため本年度は、GBR恒常発現HEK細胞株の作成、及びこのHEK細胞株を基にしたGBR恒常発現mGluR1誘導発現HEK細胞、及びGBR恒常発現mGluR5誘導発現HEK細胞の作成を行った。クローン数や発現量の点で多少の困難があったものの、概ね順調に各細胞株を作出できた。これらの細胞株を用いることで、mGluR1やmGluR5の発現量を細かく調節しながらGBRのシグナルを解析することが可能となり、既にいくつか新たな知見が得られている。また、これらの細胞株を用いることで受容体1分子レベルでのライブイメージングが可能となり、この手法を用いて受容体間結合やリガンド結合を評価するための条件検討を進めている。総じて、概ね当初の計画通り進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
主として先述の新規ライブイメージング手法を用いて、本年度中にGBRとmGluR1の結合やシグナル調節の詳細をmGluR5との比較の中で明らかにし、結合に対する外的な介入方法を確立する。得られた介入方法を用いて、Aβo-PrPC複合体により生じる細胞内シグナルに変化があるかどうかをHEK細胞株上で評価し、さらに海馬初代培養神経細胞でシナプス毒性に変化があるかどうかを観察して、「mGluR1はGBRとの結合を介したGBRシグナル抑制作用によりシナプス毒性に拮抗する」という仮説を検証する。
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| Causes of Carryover |
昨今のCOVID-19の流行や世界情勢不安により物流が不安定となり、実験に必要な物品の納入に遅れが生じたことが主な原因である。また、新規のモデル細胞株作成にあたって困難があり、その間に実施予定であった実験が行えず多少の遅れがあったことも影響している。幸い物流の状況は改善しつつあり、また、実施予定であった実験はモデル細胞株作成後には当初の計画通り実行できている。そのため次年度は概ね当初の計画通りの研究遂行が可能と考える。
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