血流感染症における新規迅速診断法の開発と重症度判定の臨床的有用性の評価

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K15688
• Research Institution: Fukushima Medical University
• Principal Investigator: 丹野 大樹 福島県立医科大学, 保健科学部, 助教 (90837527)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 血流感染症 / 敗血症 / デジタルPCR

Outline of Annual Research Achievements

敗血症は、医療が発達した現代においても死亡率が30～50%と治療困難な病態であり、「早期診断と早期治療介入」が救命率を改善させる最も効果的な手段とされている。敗血症診断の臨床検査法として敗血症マーカーと血液培養検査の２つが用いられているが、早期診断と早期治療介入が重要な敗血症診断において現状の臨床検査法では不十分といえる。本研究は、第３世代PCRと呼ばれるデジタルPCR技術を用いて、敗血症診断の新たな臨床検査法の開発を目指すことを目的としている。デジタルPCRは微量な核酸検出や細菌の絶対定量が可能であり、本研究により培養前検体からの新たな細菌検出法の確立や血中細菌数を指標とした敗血症の重症度・治療効果判定への応用が期待される。
本研究では、デジタルPCRでどの程度微量な核酸検出が可能となるのかが重要になってくる。基礎的検討として、まずTotal bacteria検出用FAM標識probe/primerを用いてデジタルPCRの検出限界を確かめた。初期の検討ではバックグラウンドの蛍光強度が強く（70copies/μL）、微量な核酸検出に干渉し大きな問題となったが、試薬調整や実験手技等の見直し、環境サンプル対応のマスターミックスを用いることでこの問題を解決した。次に、どの程度微量な核酸が検出できるかを、大腸菌ゲノムDNA 1ng, 0.1ng, 0.01ng, 0.001ngの４点で検討した。ネガティブコントロールでも1copies/μL程度はバックグラウンドとして検出されてしまうものの、大腸菌ゲノムDNAが 0.001ngと微量であっても3copies/μL程度検出され、ネガティブコントロールと明確に区別することができた。これらの検討結果から、最適なPCR条件の設定や検出可能な細菌数の把握という初年度の研究計画はおおむね達成できたといえる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度の研究計画であった最適なPCR条件の設定やデジタルPCRにおいて検出可能な細菌数の把握という目的はおおむね達成できたため。

Strategy for Future Research Activity

初年度の研究結果を受けて、2023年度は健常者血液に大腸菌などの既知細菌を加えて擬似検体を作製し、実際に様々な病原微生物が検出できるかを検討する。現在直面している問題として、新型コロナウイルス感染症による世界的なPCR関連の物資不足の影響を受け、デジタルPCRの試薬消耗品の製造が急きょ中止され今後一切入手できないという状況に陥っている。研究遂行に支障が出ないよう早急に試薬消耗品が入手可能な代替機器へと変更し研究を遂行する計画である。

Causes of Carryover

新型コロナウイルス感染症による世界的なPCR関連の物資不足の影響を受け、研究に使用するデジタルPCRの試薬消耗品の製造が急きょ中止され今後一切入手できないという状況に陥ったため、計画通りに研究費を使用できなかった。2023年度は代替機器により研究を遂行するため当初の計画通り試薬消耗品の購入に充当する。