2022 Fiscal Year Research-status Report
ヒトiPS細胞を用いたDEPDC5遺伝子異常難治性てんかんの病因メカニズムの解析
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22K15694
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
堀内 優奈 順天堂大学, 医療科学部, 助教 (20912900)
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2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | てんかん / DEPDC5 / iPS細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DEPDC5は近年新しく検出された成人性薬剤抵抗性てんかんの関連遺伝子である。DEPDC5は従来てんかん遺伝子として知られてきたイオンチャネルや神経伝達物質受容体とは全く異なる因子であり、その病因メカニズムが不明なため薬剤の選択に難渋する。そこで、本研究ではDEPDC5遺伝子変異を導入したヒトiPS由来神経細胞モデルを作成し、そのてんかん発症メカニズムを解明・検証することを目的とした。
本研究においては、てんかん患者で検出されたDEPDC5遺伝子変異および臨床データの集積を行い、てんかんの分類や予後(再発の有無と程度)、脳波 (パターンと起源等)との関連について一部解析を進めている。また、CRISPR-Cas9法を用いてヒトiPS細胞に遺伝子変異を導入し、DEPDC5ノックアウトiPS細胞(heterologous/homologous)を作製した。DNAシーケンス、RNAシーケンス、質量分析法などを用い、DEPDC5がノックアウトされていることを確認した。
今後は作製したiPS細胞を神経細胞へと分化させ、RNAシーケンスを用いて遺伝子発現解析を行うほか、パッチクランプ法、カルシウムイメージング法などを用いて機能評価を行う。また、DEPDC5変異がどのような経路やタンパク質を介して細胞異常興奮を引き起こすのか、機序解明につながる経路の同定をWestern Blot法や免疫染色等を用いて目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初予定していた研究計画においては、(A)臨床データの集積と解析を2022年度-2023年度に、(B)ゲノム編集によるDEPDC5ノックアウト細胞作製と遺伝子発現解析を2022年度-2023年度に、(C)DEPDC5ノックアウト細胞における機能解析を2022年度-2024年度に行う予定であった。
(A)臨床データの集積と解析については、臨床データの集積を行い、てんかんの分類や予後、脳波との関連について一部解析を進めており、おおむね順調に進展している。
(B)ゲノム編集によるDEPDC5ノックアウト細胞作製と遺伝子発現解析については、ゲノム編集によるDEPDC5ノックアウト細胞を作製した。おおむね順調に進展していると言える。
(C)DEPDC5ノックアウト細胞における機能解析は現在(B)で作製したDEPDC5ノックアウト細胞を神経細胞に分化させている最中であり、やや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初予定していた研究計画においては、(A)臨床データの集積と解析を2022年度-2023年度に、(B)ゲノム編集によるDEPDC5ノックアウト細胞作製と遺伝子発現解析を2022年度-2023年度に、(C)DEPDC5ノックアウト細胞における機能解析を2022年度-2024年度に行う予定である。
(A)臨床データの集積と解析については、2022年度に引き続き臨床データの集積を行い、てんかんの分類や予後、脳波との関連について一部解析を進めていく。
(B)ゲノム編集によるDEPDC5ノックアウト細胞作製と遺伝子発現解析については、ゲノム編集によるDEPDC5ノックアウト細胞の作製が2022年度に終了しており、2023年度にはDEPDC5ノックアウト細胞を神経細胞に分化させ、RNAシーケンスによる遺伝子発現解析を行う。
(C)DEPDC5ノックアウト細胞における機能解析は現在(B)で作製したDEPDC5ノックアウト細胞を神経細胞に分化させており、2023年度-2024年度にパッチクランプ法、カルシウムイメージング法などを用いて機能評価を行う。また、DEPDC5変異がどのようにして細胞異常興奮を引き起こすのか、機序解明につながる経路の同定をWestern Blotや免疫染色等を用いて行う。
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| Causes of Carryover |
DEPDC5ノックアウトiPS細胞を作製する実験計画において，COVID-19の流行や世界的流通の問題により、試薬等の入手に大幅な遅延を来したため。試薬入手の目処が立ったことから次年度以降に本年度遂行予定だった実験計画を実施する。
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