Elucidation of ALS pathology caused by disruption of NEK1-mediated cell signaling pathway

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K15702
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 渡辺 靖章 東北大学, 医学系研究科, 大学院非常勤講師 (70897735)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 筋萎縮性側索硬化症 / リン酸化 / NEK1 / RNA結合タンパク質 / シグナル伝達経路 / ALS

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、孤発性を含む筋萎縮性側索硬化症　(ALS) のリスク遺伝子であるNever in mitosis gene A-related Kinase 1 (NEK1) の翻訳産物であるセリン・スレオニンキナーゼNEK1に着目し、リン酸化の標的となる基質タンパク質を同定した上で、運動ニューロン死というALSの根本的病態に至るカスケードの一旦を解明することを目的としている。
今年度は、野生型・変異型NEK1の活性を評価するためのin vitroアッセイの確立と、NEK1欠損/過剰発現SH-SY5Y細胞をサンプルとしてNEK1のリン酸化基質をプロテオミクス技術により探索することを予定していたが、後述の理由により、完了には至っていない。このため、予備的検討において見出されたNEK1の基質タンパク質について、リン酸化の病的意義の解析をすすめる方針に切り替えた。具体的には、ALSの運動ニューロン病理におけるTDP-43の核外移行・凝集体形成などからRNA代謝障害はALSの主要病態と想定されているが、申請者はALS患者で遺伝子変異が報告されている複数のRNA結合タンパク質のリン酸化を検討し、その中にNEK1によってリン酸化されるタンパク質Xがあることを見出した。そのタンパク質Xについて、NEK1によるリン酸化の標的となるコンセンサス配列を含む部位に着目して、リン酸化部位の同定を試みている。また、CRISPR/Cas9を用いてXの遺伝子にALS関連変異をノックインしたSH-SY5Y細胞の作出を行い、NEK1によるリン酸化の程度の違いとその生物学的意義について解析を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

申請者はNEK1のリン酸化活性を評価するアッセイ系の確立を試みたが、NEK1は1000アミノ酸を超えるやや大きなサイズであるため大腸菌からのリコンビナントタンパク質の精製は難しく、in vitroの評価系は構築できていない。また、当初はNEK1欠損あるいは過剰発現SH-SY5Y細胞を作出した上でプロテオミクス解析による網羅的な基質スクリーニングを予定していたが、クローニングの過程で細胞死に至ってしまい、NEK1欠損細胞の作出には至っていない。このため、やや遅れていると判断した。

Strategy for Future Research Activity

近年、リン酸化はTDP-43をはじめとするRNA結合タンパク質の液-液相分離 (Liquid-Liquid Phase Separation: LLPS)に影響を与え、その機能や易凝集性に影響を与えるという有力な研究結果が複数報告されている。今後は予備的検討で見出したRNA結合タンパク質Xに着目し、NEK1によるリン酸化部位の同定をおこなう。NEK1によるリン酸化が、Xの持つRNA代謝能とLLPSに基づく易凝集性をどのように変容させるかをRNAシークエンスやFRAP (fluorescence recovery after photobleaching)などの各種解析手法を用いて明らかにし、iPS細胞由来運動ニューロンを用いた表現型解析につなげたいと考えている。

Causes of Carryover

NEK1遺伝子欠損細胞を取得後にリン酸化基質のスクリーニングを予定していたが、欠損細胞の取得に失敗したために、リン酸化基質の網羅的解析を行うことができなかった。代替の実験計画として、RNA結合タンパク質XがNEK1によりリン酸化されないような変異を導入した細胞のRNAシークエンス等を計画している。また、次年度はタンパク質XのLLPSを解析する実験に必要な物品費も必要である。