骨格筋組織維持における毛細血管幹細胞の多分化能を規定するNinjrun1の役割

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K15723
• Research Institution: Asahikawa Medical College
• Principal Investigator: 鹿野 耕平 旭川医科大学, 医学部, 客員助教 (10835135)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 骨格筋再生 / 毛細血管周細胞 / Ninjrin1 / サルコペニア / 神経再生

Outline of Annual Research Achievements

研究目標；CapSCを含むPCのNinj1が骨格筋組織の再生・維持における役割を明らかにする。
Ｎｉｎｊ１欠損マウスモデルの作成；PCsに発現しているNinj1をTamoxifen処理により特異的にノックアウト誘導するマウス(NG2-CreER/Ninj-Floxp)を用いた。対照マウスとして、NG2-CreERマウスにTamoxifen処理を施した群とTamoxifen処理を行わない群を用いた。Tamoxifen処置後に下腿腓腹筋およびヒラメ筋の筋挫滅を施行した。
筋挫滅モデルマウスの作成と筋再生の評価： 上記で準備したマウスの下腿筋にCardiotoxinを用いて筋挫滅モデルを作成する。各グループは４匹のオスマウスを使用した。筋挫滅後;4週間後に骨格筋組織を摘出し、組織学的評価を行った。組織学的評価はHE染色及び蛍光免疫染色（dystrophin染色）を行った。画像解析はImageJ Fijiによる骨格筋短軸像での骨格筋繊維の面積計測を行った。結果；腓腹筋の短軸切片のHE染色をNinj1 KO群と対照群で比較したところ、Ninj1 KO群で筋線維面積が有意に減少しており、ヒストグラムでは小形成筋線維が増加した。結論；周細胞特異的Ninj1ノックアウトマウスにおいて骨格筋障害後の筋線維径の低下からNinj1が骨格筋再生に寄与する可能性が示唆された。これらの結果から周細胞からの筋繊維への分化へ過程、周細胞による血管再生への過程、周細胞から神経分化し神経再生への過程による多面的な骨格筋再生過程を想定し、これらの仮説を踏まえさらに周細胞による骨格筋再生においてNinj1との関係性について詳細に評価していく。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

私たちは研究課題申請時に定めた目標であるNG2特異的Ninj1欠損マウスでの筋組織再生の評価についての知見を得た。それは周細胞特異的Ninj1ノックアウトマウスにおいて骨格筋障害後の筋線維径の低下からNinj1が骨格筋再生に寄与する可能性が示唆された。さらに我々は周細胞特異的Ninj1欠損マウスと周細胞特異的TdTomato発現させ、細胞追跡が可能なマウスを交配した。このマウス系統によりNinj1を特異的に欠損させた周細胞を追跡し組織学的評価することが可能となった。これは骨格筋再生の評価だけではなく、血管新生や神経再生の評価にも役立つ。私たちはこれらのマウスを使用し、周細胞が組織再生にどのように寄与するのか詳細な評価を行っていく。これらは私たちが研究課題申請で示した研究目標に含組んでいる。

Strategy for Future Research Activity

私たちはIn Vitroにおいても以下の目標を定め検証する。
目標１　Ninj1がCapSCsの骨格筋線維の分化能に関与するか明らかにする。骨格筋由来PCsおよびCapSCsの調整；PCs特異的に赤蛍光するNG2-DsRedマウスと全細胞で緑蛍光するGFPマウスさらに両マウスを掛け合わせたNG2-DsRed/GFPマウスを用いて(本講座の別プロジェクトで使用中)、骨格筋組織からPCsさらにその中からEphA7陽性CapSCsをFluorescence activated cell sorting(FACS)あるいはMagnetic cell sorting(MACS)法で分離調整する。骨格筋分化能の評価；　CapSCsの単独培養あるいはマウス筋衛星細胞由来の筋芽細胞株であるC2C12細胞との共培養システムを用いて、骨格筋への分化誘導を行い、分化能を評価する。Ninj1遺伝子のgain/loss of function 評価；上記の細胞において、Ninj1特異的siRNAを用いて内在するNinj1発現を抑制あるいはNinj1過剰発現ベクターを用いたNinj1過剰発現させ、骨格筋分化能を評価する。
目標２　Ninj1は、CapSCsの神経再生および血管形成に関与するか明らかにする。
神経分化能および血管分化・形成能の評価； 目標１で調整したCapSCsについて神経分化能またはゲル上培養での血管分化能を免疫染色により評価する。また実験１と同様にNinj1を抑制または強発現の効果を評価する。後根神経節とCapSCsとの共培養評価；　CapSCsとDRG神経組織を共培養させ、血管および神経軸索伸長をライブイメージングにて観察し、CapSCsによる神経軸索伸長促進効果を評価する。なお、神経軸索観察のため、神経軸索が緑蛍光するThy1-YFPマウスからDRGを調整する。

Causes of Carryover

次年度使用額が生じた。これは本年度で準備する予定であった試薬の発注調整に時間を要し次年度での試薬購入にずれ込んだためである。この状況を踏まえて次年度での研究費の使用計画を修正し運用していく。