2022 Fiscal Year Research-status Report

Development of Innovative Therapies for Gut Microbiota-Related Neurodegenerative Diseases Based on Comprehensive Metagenomic Analysis

Research Project

Project/Area Number	22K15733
Research Institution	Osaka Metropolitan University
Principal Investigator	植松未帆大阪公立大学, 大学院医学研究科, 助教 (80815647)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2027-03-31
Keywords	メタゲノム解析 / メタボローム解析 / 腸内細菌叢 / 腸内ウイルス叢 / アルツハイマー型認知症 / パーキンソン病関連疾患 / 次世代シークエンサー / 遺伝子機能解析
Outline of Annual Research Achievements	腸内では腸内細菌やバクテリオファージ（ファージ）が相互関係を保ちながら恒常性を維持している。腸内細菌叢は、ビタミンや補酵素、アミノ酸、脂肪酸、神経伝達物質の生合成など、宿主であるヒトにとって有益な機能を有して共生していることから、「もう一つの臓器」ともいわれ、近年では腸内細菌叢の破綻（ディスバイオーシス）がパーキンソン関連疾患やアルツハイマー型認知症などの神経変性疾患の病態へ関与する可能性も示唆されている。腸内細菌叢の遺伝子のショットガンシークエンシング（長い遺伝子配列を短いランダムな断片としてクローニングして配列決定したのちに、断片のオーバーラップ部分をコンピュータ解析により結合し、元の長い配列を再構築する手法）によって、全メタゲノム解析を行えば、腸内細菌叢を構成する細菌種を同定し、なおかつそれらの菌の持つ遺伝子がコードする蛋白質の機能、および各遺伝子の相対的存在量（アバンダンス）を調べることができる。本研究の目的は、パーキンソン関連疾患やアルツハイマー型認知症患者の糞便サンプルの腸内細菌叢のメタゲノム解析により疾患に特徴的な腸内細菌叢の破綻（ディスバイオーシス）を同定すること、および、糞便のメタボローム解析および腸内細菌叢の遺伝子機能解析を併せて行うことにより、疾患において相対的に機能低下する代謝経路や、異常に亢進する代謝経路、細菌による薬剤の分解経路、細菌由来アミロイドの生合成などの、疾患群に特有の変化を見出し、治療標的となる共生病原腸内細菌（パソビオント）およびその代謝経路を同定することである。さらに、同定したパソビオントを制御するため、標的細菌ゲノム上の溶原ファージ配列から溶菌酵素配列を抽出することによって次世代ファージ療法の基盤情報を取得することである。本年度は、これらの目的に沿って研究を進めた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 先行研究ではアルツハイマー型認知症およびパーキンソン病関連疾患患者の糞便サンプルおよび健常人の糞便サンプルを取得し解析したが、本研究ではさらにサンプル数を増やし、得られた糞便サンプルからの微生物叢の遺伝子抽出を行い、次世代シークエンサー用のカスタムアダプター配列を連結してライブラリを作成し、塩基配列を決定してメタゲノム解析した。健常者群と疾患群での細菌叢の遺伝子機能の違いを明らかにするためパスウェイ解析を行った。また、遺伝子解析用の糞便と同一のサンプルについて、メタボローム解析を行い、患者糞便中で低下・上昇する代謝物の有無を探索した。さらに、メタゲノム解析によりディスバイオーシスに最も寄与すると考えられる菌種について検討し、同一サンプル由来の腸内のバクテリオファージの配列やデータベースと照らし合わせて感染関係にあるプロファージ配列を探索し、その配列中にあるエンドライシン等の溶菌酵素配列を検索し次世代ファージ療法の基盤情報を取得した。以上のように実験計画通り概ね順調に進展している。
Strategy for Future Research Activity	今後は、サンプル数をさらに増やし、メタゲノム解析・メタボローム解析を継続する。また、同定した溶菌酵素配列について、蛋白質の生成を行い、ディスバイオーシスに寄与する菌に対して投与し、特異的溶菌効果があるかどうかを検証する。また、本研究で得られた知見から将来の動物実験等の実験系を検討し、マウス糞便移植実験等に備えて嫌気条件化での糞便サンプル冷凍保存を行う等、新たな治療法を見出す準備を行う。
Causes of Carryover	本年度の研究においては、購入済みの一般的な試薬から施行可能なものが多く含まれていた。次年度、物品費を中心に研究を進めるために使用する。