2022 Fiscal Year Research-status Report
D2R-mediated Gs/Gi rebalancing in ALS motor neurons
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22K15736
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
森本 悟 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 特任講師 (00816952)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2027-03-31
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| Keywords | ALS / 運動ニューロン / ドパミンD2受容体 / Gタンパク質 / アデノシンA2A受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度の研究実施計画：ヒトiPS細胞の脊髄運動ニューロンへの分化誘導：Chemically Transitional embryoid-body-like State (CTraS)法およびSendai virusを用いて、健常者ならびに家族性（孤発性）ALS患者由来ヒトiPS細胞にlhx3, ngn2, islet1の３因子を導入し、ヒト脊髄運動ニューロンに迅速かつ高効率に分化させる。
今年度の研究実績：健常者（４検体）ならびにゲノム編集を含む家族性ALS患者（TARDBP変異あるいはFUS変異を有する４検体）由来iPS細胞から迅速かつ高効率にヒト脊髄運動ニューロンを誘導する方法を開発した。これまでの方法では、脊髄運動ニューロン誘導の効率が悪く純度も低く、また誘導や評価の手順が複雑であるなどの制約があった。この新しいプロトコールでは、低分子ベースのアプローチ（CTraS法）と転写因子の導入（lhx3, ngn2, islet1、あるいはLHX3, NGN2, ISLET1）を組み合わせ、わずか2週間で80％近い誘導効率を達成した。また、細胞の不均一性を克服するため、iPS細胞由来のLMNの形態と生存率を、タイムラプス顕微鏡と機械学習/深層学習を用いて個々の細胞ごとに解析し、高精度な病態生理評価システムを確立した。このような迅速かつ高効率で簡便なプロトコールと1細胞単位の評価手法により、iPS細胞由来脊髄運動ニューロンを用いた大規模病態解析や創薬スクリーニングへの応用が可能となる。
上記成果について、下記プレプリントサーバーより参照可能。
Selena Setsu, Satoru Morimoto, Shiho Nakamura, Fumiko Ozawa, Yukihide Tomari, Hideyuki Okano. An efficient induction method for human spinal lower motor neurons and high-throughput image analysis at the single cell level. bioRxiv 2023.04.18.537412; doi: https://doi.org/10.1101/2023.04.18.537412
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題の第１ステップである、“iPS細胞からのヒト脊髄下位運動ニューロンの迅速かつ高効率な分化誘導法と解析システム”を確立するとができ、今後の研究ステップの下地を築くことができたため（現在本成果について、プレプリントサーバーであるbioRxivに掲載し、かつ国際論文投稿中）。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、第２ステップである“健常者およびALS患者由来脊髄運動ニューロンにおけるGs/Giバランスとリン酸化カスケード”の解明に向けて、確立した運動ニューロンの分化誘導法を用いて、下記のプロセスを実施していく。
“健常者ならびにALS患者由来脊髄運動ニューロンの定常状態において、イムノブロットおよび各種リン酸化モチーフ抗体（PKA, PKC, MAPK/CDK, ATM/ATR, Akt, AMPK, CK2）を用いて、リン酸化シグナル伝達活性の評価を行う。”
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| Causes of Carryover |
iPS細胞の培養維持・分化誘導に関わる消耗品費用が、今年度は想定より少なくなったため、次年度の同項目消耗品購入計画に繰り入れる。
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