2022 Fiscal Year Research-status Report
ジスルフィド消失TPO変異による先天性甲状腺機能低下とERストレス発生機序の究明
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22K15930
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
谷古宇 史芳 東京医科大学, 医学部, 助教 (00817348)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | ジスルフィド結合 / in silico立体構造解析 / プロテアソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
先天性甲状腺機能低下症(CH)は頻度の高い先天性内分泌機能障害として知られているが、 適切な治療介入がなければ精神遅滞を合併し得る。甲状腺ペルオキシダーゼ(TPO)変異はCH をきたす代表的な遺伝型だが、そのメカニズムや脳の発達への影響は明らかにされていない。
我々が報告したTPO変異(以下Cys655Phe)症例においても精神遅滞を認めた。TPO変異による機能低下の要因として、仮説ではジスルフィド結合の消失によるタンパクの不安定化、ユビキチン化の障害、分子シャペロンを含むERストレスを介する機序等が推測された。TPOのタンパク構造においてシステイン間で成り立つジスルフィド結合がTPOの機能と構造の維持に重要であると考えられるため、ジスルフィド結合消失によるERストレスや分子シャペロンがどの様に生じ、甲状腺機能低下の病態に関与するかが本研究課題の問いである。
令和4年度はin silico立体構造解析によりTPOにおける12か所のジスルフィド結合を同定し、ジスルフィド結合を構成するシステインをセリンに置換したプラスミドをヒト胎児腎細胞株にトランスフェクションし機能解析と、タンパク質の立体構造の変化を確認した。
TPO内の12か所のジスルフィド結合を構成する24か所のシステインをセリンに変換したTPO変異を作成し、各々のペルオキシダーゼ活性を測定し、野生型と比較しすべての変異型は活性低下を認めた。
また既知のTPO変異であるCys655PheとCys825Argにおいて、プロテアソーム阻害薬付加後のタンパク発現量とペルオキシダーゼ活性を確認したところ、タンパク発現量は改善したが、ペルオキシダーゼ活性は十分に改善しなかった。上記結果より、TPOのジスルフィド結合消失による立体構造変化自体の変化と同時に、プロテアソームの分解がペルオキシダーゼ活性の低下関与する可能性が示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々の報告した変異以外のジスルフィド結合に関与する他のTPO変異における機能低下を細胞実験レベルで示すこと、野生型と比較したTPOの細胞内局在の差異を動物実験を行う前に示したいと考えた。令和4年度はin silico立体構造解析により12か所のジスルフィド結合を同定し、それぞれ置換したプラスミド16種類をヒト胎児腎細胞株にトランスフェクションし、invitroでの機能解析に加えタンパク質の立体構造の変化を確認した。TPO内の12か所のジスルフィド結合を構成する24か所のシステインをそれぞれセリンに変換したTPO変異を作成し、各々のペルオキシダーゼ活性を測定したところ野生型と比較し全ての変異型は70～90%の活性低下を認めた(P＜0.01)。さらにペルオキシダーゼ活性低下の原因を究明すべくヒトでの既報TPO変異であるCys825Argと我々が報告したCys655Pheを細胞実験で比較・観察した。プロテアソーム阻害薬であるMG132を使用しタンパク発現量とペルオキシダーゼ活性を確認したところ、タンパク発現量は改善したが、ペルオキシダーゼ活性は十分に改善しなかった。上記結果より、TPO変異ではのジスルフィド結合消失による立体構造変化自体と同時に、プロテアソームによる分解がペルオキシダーゼ活性の低下に関与する可能性が示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
TPO変異マウスに関しては、natural mutantの報告はあるが、ノックインマウスの報告はない。そこで今回発見した新規TPO変異の655のSNPのノックインマウスをCRISPR/Cas9の技術にて成育医療センター協力のもと作成した。
タイピングにてヘテロ変異を確認し、このマウスを掛け合わせてホモ変異マウスを作成した。
ホモ変異マウスにおける甲状腺組織の観察とTSH、FT3,4を測定による甲状腺ホルモン低下を実際に確認していくことが2023年度の指針である。また、ERストレス過多でアポトーシスを誘導されているのか、もともと形成異常を生じているのか検討する必要があると考えている。
また2024年度はマウスの発達途中で甲状腺ホルモンを投与し、ローターロッドテストなどで運動学習能の改善を確認する。その他にもRNA-Seqで各遺伝子の発現量の変化を確認し、Ki69などの他の染色にて細胞増殖能などを確認したいと考えている。
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| Causes of Carryover |
2022年度は細胞実験が主であったので想定より経費が抑えられた。次年度以降は動物実験を並行して行っていくため必要経費も増加が予想されるため、2022年度の未使用額を使用させて頂く。
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