2023 Fiscal Year Research-status Report
腎糸球体上皮細胞におけるstratifinの機能の解明
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22K16235
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
安田 英紀 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 助教 (00806490)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | ネフローゼ症候群 / 14-3-3蛋白質 / 糸球体上皮細胞 / Stratifin / 細胞骨格 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Stratifin(14-3-3σ)と14-3-3βの一次突起と二次突起(足突起)の細胞骨格関連分子との相互作用を明らかにするため、培養ポドサイトとHEK細胞の発現系で免疫沈降法(IP)による解析を行った。培養ポドサイトとHEK細胞の発現系でStratifinが一次突起のvimentinと相互作用する事を明らかにした。また、Stratifinは足突起のアクチン関連蛋白質のFKBP12、synaptopodinに比べてvimentinと高い結合親和性を持つ事を示した。これに対し、14-3-3βはvimentinに比べてFKBP12、synaptopodinと高い結合親和性を持つ事を明らかにした。
次に、14-3-3βと足突起のFKBP12、スリット膜のPar極性複合体の相互作用を明らかにするため、糸球体で免疫染色、培養ポドサイトとHEK細胞の発現系でIPによる解析を行った。糸球体で14-3-3βは主に足突起のFKBP12と共局在するが、スリット膜のPar3とも一部で共局在する事を示した。培養ポドサイトとHEK細胞の発現系で14-3-3βはPar3に対して結合力を持つ事を明らかにした。また、培養ポドサイトで14-3-3βのノックダウンはPar複合体を構成するPar3-Par6の相互作用を増強する事を明らかにした。更に、HEK細胞の発現系でFKBP12の導入が14-3-3βとPar3の相互作用を低下させる事を明らかにした。
これらの結果から、Stratifinと14-3-3βがそれぞれ一次突起と足突起に発現するという異なる局在は、細胞骨格関連分子への結合親和性の差による事を明らかにした。また、14-3-3βとスリット膜のPar3の結合はPar極性複合体の相互作用を抑制し、競合的な14-3-3βと足突起のFKBP12の結合がPar極性複合体の機能の維持に関与する事を明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はStratifinと14-3-3βの、ポドサイトの細胞骨格関連分子、スリット膜のPar極性複合体との詳細な相互作用を解析した。
まず、培養ポドサイトとHEK細胞の発現系でStratifinは一次突起を構成するvimentinと相互作用を示した。Stratifinのvimentinに対する結合親和性は、足突起のアクチン関連蛋白質のFKBP12、synaptopodinに比べて顕著に高かった。一方で、14-3-3βのFKBP12、synaptopodinに対する結合親和性はvimentinに比べて顕著に高かった。この事から、Stratifinと14-3-3βの細胞突起における異なる局在は細胞骨格関連分子に対する結合親和性の差による事を明らかにした。
次に、糸球体で14-3-3βは主に足突起のFKBP12と共局在するが、スリット膜のPar極性複合体を構成するPar3とも一部で共局在し、培養ポドサイトとHEK細胞の発現系で14-3-3βがPar3と結合力を持つ事を示した。また、培養ポドサイトでPar3はPar6と相互作用を示したが、14-3-3βのノックダウンはPar3とPar6の相互作用を増強した。更に、HEK細胞の発現系でFKBP12の導入は14-3-3βとPar3の相互作用を低下させた。この事から、14-3-3βとスリット膜のPar3の結合がPar複合体の機能を抑制し、FKBP12の14-3-3βに対する競合的な結合がPar複合体の機能の維持に関与する事を明らかにした。
以上の所見から、Stratifinは一次突起のvimentinに、14-3-3βは足突起のアクチン関連蛋白質に高い結合親和性を持つ事を示し、14-3-3βとFKBP12の結合がスリット膜のPar極性複合体の機能の維持に関与する可能性を示したため、本研究課題は当初の計画通りに順調に進展していると考えた。
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| Strategy for Future Research Activity |
培養ポドサイトでStratifinと14-3-3βをそれぞれノックダウンし、ポドサイトの細胞突起を構成する細胞骨格に対する影響を検討する。具体的には、Stratifinと14-3-3βをノックダウンしたポドサイトで細胞のサイズ、細胞突起形成、F-actinとvimentinの染色性への影響を解析する。次に、微小変化型ネフローゼ症候群(MCNS)モデルと巣状糸球体硬化症(FSGS)モデルの糸球体、adriamycin(ADR)によって傷害を誘導した培養ポドサイトの病態初期と後期でStratifinと14-3-3βの発現の変化のポドサイトの一次突起と足突起への影響を解析する。具体的には、それぞれのネフローゼ症候群モデルの糸球体でvimentinとsynaptopodinの染色性を、傷害を誘導した培養ポドサイトで細胞突起形成とvimentin、F-actinの染色性への影響を解析して、各病態モデルで観察されたStratifinと14-3-3βの発現変化との関連性を検討する。更に、培養ポドサイトでStratifinと14-3-3βをダブルノックダウンし、巣状糸球体硬化症(FSGS)やADR添加の培養ポドサイトの病態後期に見られた細胞骨格への影響が再現されるか検討する。また、これまで得られたポドサイトにおける14-3-3蛋白質の機能に関する一連の所見をまとめて論文の投稿を行う。
更に研究を発展させて、腎臓内の他の細胞や他の臓器における14-3-3蛋白質の機能の解析を行う。
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