ヒトiPS細胞由来腎臓オルガノイドを用いたLMX1B変異に伴う腎症の病態解明

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K16246
• Research Institution: University of Miyazaki
• Principal Investigator: 田中 悦子 宮崎大学, 医学部, 助教 (00612376)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: LMX1B / 腎臓 / オルガノイド / iPS細胞 / ヒト / ポドサイト

Outline of Annual Research Achievements

LMX1Bバリアントに関連した腎症は、LMX1B遺伝子の病的変異によって起こる腎臓病である。ヒトではLMX1Bのヘテロ変異により蛋白尿をきたし、末期腎不全に至ることがある。私達は、これまでに、LMX1Bバリアントに関連した腎症で腎機能障害がある家族を報告した。
本研究は、LMX1Bに変異があるiPS細胞から腎臓様構造を試験管内で作る(腎臓オルガノイド)ことで、LMX1Bバリアントに関連した腎症を再現し、病態解明と治療法開発の基盤づくりを目指している。本年度は、患者由来iPS細胞を作製するための共同研究締結と倫理申請を行い、現在、倫理審査中である。また、健常なヒト由来iPS細胞のLMX1B遺伝子に、遺伝子編集で変異を加えたiPS細胞を複数種類作製した。患者のLMX1Bは一塩基置換により1つのアミノ酸が変異している。一方、遺伝子編集では、1対あるLMX1Bの両方あるいは片方に変異以降のアミノ酸が欠失するあるいは全く異なるものになる変異を起こすことができた。前年度も、同様に遺伝子編集でLMX1B変異をもつiPS細胞を作製したが、作製の過程で未分化性が失われており、腎臓オルガノイドの誘導率が低かった。そのため、前年同様に遺伝子編集を行った後、クローニングの際にiPS細胞の未分化性・多能性を維持できるように培養条件を再検しながら、実験を進めた。そして、樹立した複数の変異株を用いて、既報（Taguchi et.al.,Cell Stem Cell, 2014）に基づき腎臓オルガノイドを作製できることを確認した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

遺伝子編集iPS作製に難渋し、また、患者由来iPS細胞作製の計画も遅れた。

Strategy for Future Research Activity

今後は、作製したオルガノイドの遺伝子あるいは蛋白発現を健常なヒトiPS細胞由来オルガノイドや患者腎組織と比較検討する予定である。患者由来iPS細胞作製の準備も整いつつあるため、患者さんの同意が取れ次第、研究を進める予定である。

Causes of Carryover

患者由来iPS細胞と遺伝子編集iPS細胞、野生型iＰＳ細胞から誘導したオルガノイドを用いて、LMX1B変異が起こす腎臓の糸球体構造を1細胞の遺伝子発現レベルで解析を計画している。患者由来iPS細胞の樹立が大幅に遅れており、本年度までに予定していたシングルセルRNAシークエンス解析がまだできていない。また、同時に組織染色により蛋白発現も確認する予定だが、その抗体購入ができていない。本年は、これらを進めていく。さらに、本研究で作製するiPS細胞は遺伝子編集が比較的容易であり、また、オルガノイドは薬剤投与による効果を評価しやすい実験系である。そのため、シングルセルRNAシークエンスなどの結果を用いてLMX1B変異で起こる特徴的な遺伝子変化を同定し、その遺伝子を目印にした治療薬スクリーニングの実験系樹立に着手する予定である。