2022 Fiscal Year Research-status Report
Elucidating excessive fibrosis in systemic sclerosis via abnormal IRF8 expression
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22K16287
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
乙竹 泰 横浜市立大学, 医学部, 助教 (10909427)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2027-03-31
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| Keywords | 全身性強皮症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①骨髄特異的IRF8ノックアウトマウス（IRF8cKOマウス）の肺組織について評価を行った。
(i)まず、無治療のIRF8cKOマウスと野生型マウスの肺組織の比較を行った。IRF8cKOマウスで肺の線維化は認めず、同マウスは肺において線維化を自然発症しないと考えた。
(ii)次に、線維化を誘導するためにブレオマイシンの投与を行った。ブレオマイシンの投与経路については、背部の皮下投与および気管内投与の2種類の方法を採用した。肺組織については、重量、病理組織、qRT-PCR、総コラーゲン量測定（ヒドロキシプロリンアッセイ）によって線維化の評価を行った。皮下投与においては野生型マウスと比較してIRF8cKOマウスにおいて線維化の亢進は見られなかった。気管内投与においても一部でIRF8cKOマウスにおいて線維化の亢進を示唆する所見は見られたものの、野生型と比して統計学的に有意な線維化誘導は認めなかった。
②今後の組織からのマクロファージ抽出を念頭に、皮膚や肺組織について組織からの細胞抽出の予備実験を行った。マウスの皮膚、肺についてコラゲナーゼを用いて組織の溶解を行ったが、特に皮膚において分解に難渋したたため、条件の最適化にむけて実験を継続する。
③今後の線維芽細胞との共培養を念頭に、ヒト単球におけるIRF8のノックダウンについて予備実験を行った。siRNAを用いたRNA干渉法によるノックダウンを行った。これまで当教室で使用しておりノックダウン方法が確立した試薬の販売停止に伴い、新たな試薬を用いて条件検討を行った。ノックダウン効率がまだ低いため、今後も最適化のための実験を継続する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
おおむね当初の計画の通りに実験を行っている。しかしながら、当初予想されていたのとは異なり骨髄球特異的IRF8ノックアウトマウスにおいては肺の線維化は自然発症せず、かつブレオマイシンを用いた線維化誘導でも、野生型と比して有意な線維化は誘導されなかった。今後線維化誘導の条件を再検討するとともに、肺以外の臓器における線維化についても解析を進める。
組織からの細胞抽出については特に皮膚については組織が固く細胞抽出に難渋した。今後も条件検討を続ける。
単球におけるRNA干渉法によるノックダウンについても、適切な試薬の選定に時間を要している。また、siRNAの販売元からのリコールもあり、再実験が必要となったが徐々にノックダウン効率が向上しており、最適化を続ける。
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| Strategy for Future Research Activity |
骨髄球特異的IRF8ノックアウトマウスにおいて、肺に線維化を誘導する条件について再検討を行う。また、肺以外の心臓、腎臓、消化管などの臓器における線維化について解析を進める。
線維化を認めた臓器においてはPCR法やウエスタンブロットによって線維化を誘導するサイトカインや転写因子の解析を行い、機序解明を目指す。
線維化がみられた臓器においてはマクロファージの抽出を行い、機能解析を行う。現状では細胞抽出の条件が整っていないため、引き続き予備実験として抽出の条件検討を行う。
マウスの実験において線維化が見られた臓器においては、対応するヒトの臓器においてマクロファージにおけるIRF8の発現検討を行う。さらに、ヒト単球においてIRF8をsiRNA法によりノックダウンし線維芽細胞と共培養することによってヒトにおいてもIRF8低下単球が線維化を誘導する機序を証明する。
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| Causes of Carryover |
骨髄球特異的IRF8ノックアウトマウスにおいて、当初予想していた肺の線維化が現状では見られなかったことにより、それに付随した追加解析を行うことができなかったため、当初予想よりも支出額が低くなった。そのため次年度使用額が発生した。次年度以降、肺の線維化について条件検討を進めるとともに、肺以外の臓器においても広く線維化を評価していくことにより、差額分の金額を使用していく。
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