2022 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of Functional Regulation Mechanisms of Breast Cancer-Related Molecules by O-Glycosylation
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22K16448
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
高橋 一人 福島県立医科大学, 保健科学部, 講師 (70791606)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | O型糖鎖 / 糖転移酵素 / Galnt6 / 乳癌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
乳癌においてO型糖鎖に対する糖転移酵素Galnt6の発現亢進と癌の増悪の関連性が報告され、Galnt6が予後予測や抗癌剤の標的として注目されている。我々は、乳癌で過剰発現するO型糖転移酵素Galnt6が、基質であるエストロゲン受容体（ER）、膜結合型ムチンMUC1や細胞接着分子などの癌関連タンパク質に糖鎖を付加することで、これらの分子の機能発現をどのように制御するか、その分子機構を明らかにすることを目的としている。
令和4年度は、2つの異なるサブタイプの乳癌細胞株、MCF-7（ER+, PR+, HER2-）とMDA-MB-231（トリプルネガティブ）を対象に、Galnt6、ER、MUC1や細胞接着分子の発現や細胞内局在をウェスタンブロットや免疫細胞染色にて解析した。さらにGalnt6による糖鎖修飾がこれらのタンパク質の機能制御に果たす役割を明らかにするため、CRISPR-Cas技術でGalnt6を欠損させたMCF-7を作出し、同様の解析を行った。
今回の結果にて、Galnt6との関連が示唆される基質タンパクが見つかった。本タンパクおよび関連分子の動態について、ウェスタンブロットやレクチンブロット、qPCRなどを行い解析を進める。さらに外科的に切除された臨床乳癌組織の解析も実施し、病態制御因子としての有用性についても検証を進める。また野生型MCF-7とGalnt6欠損MCF-7のRNA-seq解析を行い、網羅的に両者の遺伝子発現を比較検証する。これら解析によって、より詳細なGalnt6による細胞制御機構が明らかになることが期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
令和4年度は、異なるサブタイプの乳癌細胞株のMCF-7とMDA-MB-231、さらにCRISPR-Cas技術でGalnt6を欠損させたMCF-7を対象として、Galnt6、ER、MUC1や細胞接着分子の発現や細胞内局在をウェスタンブロットや免疫細胞染色にて解析した。
Galnt6欠損MCF-7の作出は、Galnt6を標的とした研究を進める上で重要なポイントである。MCF-7はaneuploidyであることもあり、Galnt6欠損株の作出に想定以上の時間を要したが、最終的にウェスタンブロットで検出感度以下にまで発現を抑制した欠損株を作出することができた。
一方、動物実験施設が地震補修による利用制限のため、動物実験は系統維持に留まった。これらより、進捗状況を「やや遅れている」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はGalnt6欠損MCF-7のrescue実験を行い、再びGalnt6が発現すること、さらに関連分子の動態が野生型のMCF-7と同等レベルになることを確認する。
令和4年度の解析で示されたGalnt6の基質タンパク候補と関連分子を中心に検証を進め、標的分子の細胞内分布やO型糖鎖付加とタンパク質発現の関連性を評価する。加えて、外科的に切除された臨床乳癌組織のパラフィン包埋組織から核酸を抽出し、Galnt6と関連分子のmRNAを測定し、病態制御因子としての有用性を検証する。また野生型MCF-7とGalnt6欠損MCF-7のRNA-seq解析を行い、網羅的に両者の遺伝子発現を比較し、Galnt6による細胞制御機構を明らかにする。
令和5年度は動物実験施設の地震補修が終了し、通常通り使用することが可能なため、Galnt6欠損マウスの繁殖を開始し、呼吸器、消化器、生殖器の主要臓器を対象に、組織化学的解析および分子生物学的解析を実施する。
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| Causes of Carryover |
動物実験施設が地震の補修による利用制限のため、当初予定していたGalnt6欠損マウスの解析を行うことができなかった。また、コロナ対応で予定してた学会に参加することができなかったため、余剰金が生じた。
次年度は多くの予備実験を必要とする細胞培養や生化学的解析に加え、昨年度実施できなかった動物実験を予定している。余剰金はこれら実験の物品費として使用する。
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