2022 Fiscal Year Research-status Report
Neoantigen pulse iPS cell-derived dendritic cell immunotherapy using the own organoids
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22K16498
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
北谷 純也 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (30596979)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | オルガノイド / iPS細胞 / 樹状細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
担癌患者においては、免疫の司令塔である樹状細胞の成熟能や抗原提示能の低下を呈することが知られている。これらの樹状細胞療法の弱点を克服するために、iPS細胞に着目し、iPS細胞由来樹状細胞 (iPSDCs) を用いた癌ワクチン療法の基礎研究を行ってきた。本研究の目的は、正常細胞には発現せず、腫瘍における遺伝子変異によってのみ発現するネオアンチゲンを標的としたiPSDCsの作成を行い、消化器固形癌に対する根治を目指した個別化癌ワクチン療法の開発を目的としている。まずは、この治療モデルの確立と治療効果の比較を行う細胞傷害活性のコントロールの設定のため、健常人での共通抗原を用いた研究を実施した。研究への参加の同意が得られた3名の健常人ドナーの末梢血単核球から山中4因子を導入することでiPS細胞を樹立し、分化誘導したiPSDCsに胃癌、大腸癌で発現率が高いMesothelin遺伝子をアデノウイルスベクターを用い遺伝子導入した。遺伝子の導入効率は約40％であった。Mesothelin遺伝子導入iPSDCsの成熟能に関しては、MoDCsのそれと類似するものであった。このMesothelin遺伝子導入iPSDCsにより刺激して得られたCTLsは、自己仮想targetであるMesothelin遺伝子導入LCL(lymphoblastoid cells)に対し、抗原特異的な細胞傷害活性をいずれのドナーでも示すことを証明した。その後、担癌患者のiPS樹立およびオルガノイド作成に関しては、本学の倫理委員会の承認を受け作成に取りかかっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
オルガノイド作成に関しては、やや実験が遅れている。現在、オルガノイドの保管方法に関して、当大学のバイオバンクと連携し、保管体制の確立に努めている。以下のプロトコールにより、担癌患者のオルガノイド作成に関して行うこととしている。その方法は、切除した腫瘍組織を断片化し、ストリッピングバッファー (Hankの平衡塩類溶液、エチレンジアミン四酢酸5 mmol/L、HEPES 25mmol/L、10%ウシ胎児血清) に入れる。断片を振盪しながら37℃で10分間インキュベートする。ストリッピングバッファー追加し、37℃でさらに5分間インキュベートする。組織断片をHankの平衡塩類溶液で2回洗浄し、コラゲナーゼ (1.5mg/mL)とヒアルロニダーゼ (20mg/mL) を添加したRPMIを断片に加え、37℃で30分間インキュベートする。DPBSで希釈し、フィルターで濾過した後、細胞を1200rpmで5分間遠心分離しマトリゲルに包埋する。
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| Strategy for Future Research Activity |
オルガノイドの作成と保管に関して確立できれば、オルガノイドよりDNAを抽出し、WESおよびRNA sequenceを次世代シーケンサーで確認する。候補となるネオアンチゲンを予測し、候補となる12－15個のネオアンチゲンペプチドを合成する。樹立した癌オルガノイドよりカラム法を用いた All Prep DNA/ RNA FFPE kit (QIAGEN 社) で用手によりDNA抽出を行う。また、患者血液から正常DNAの抽出を行う。核酸抽出後、ライブラリー構築、次世代シーケンサーによるシーケンスを行う。当大学は、次世代シーケンサーを所有しており、WESおよびRNA sequenceは、外部委託無しで可能であるが、ネオアンチゲン予測に関しては、外部委託のパイプライン (Cancer Precision Medicine社) を利用する。また、候補ネオアンチゲンペプチド合成も外部企業に依頼する。担癌患者の末梢血よりiPS細胞を樹立し、iPSDCへ分化誘導およびネオアンチゲンパルスiPSDCを作成する。オルガノイドを用いネオアンチゲンパルスiPSDCにより誘導されたCTLの細胞傷害性を検討する。ネオアンチゲンパルスiPSDCをstimulatorとしてin vitroで担癌患者のリンパ球と3回刺激し、CTLを誘導する。得られたCTLの細胞傷害活性は、オルガノイドを用い、Cr release assayで比較検討する。また、CTLおよびオルガノイドにおける免疫チェックポイント分子 (PD-1/PD-L1) の発現に関してもFACSで評価する。
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| Causes of Carryover |
オルガノイドの樹立、保管に時間を要したため、やや研究計画が遅延した。RNA sequenceやネオアンチゲン予測に必要である費用を次年度に繰り越す必要があるため、次年度使用額として計上したい。
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