2022 Fiscal Year Research-status Report
Development of novel therapeutics against ion transporters expressed in cancer-associated fibroblast
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22K16518
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
清水 浩紀 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (00756827)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | colon cancer / fibroblast / ion channel / transporter |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１，大腸癌切除14症例分の正常組織由来線維芽細胞（以下NF）ならびに癌組織由来線維芽細胞（以下CAF）をセットで分離培養に成功し、上皮系マーカー（EpCAM、サイトケラチン）がNFならびにCAFに存在しないことをタンパクレベルでウェスタンブロッティングを用いて確認した。それぞれのCAFマーカー（αSMA、FAP）のタンパク、RNAレベルをWB、RT-PCRにて確認し、CAF>NFと発現が亢進している細胞ペアを抽出した。さらにそのうち、Boyden chamber法にて上層にヒト大腸癌細胞株HCT116、下層に線維芽細胞を配置し遊走能の解析を行い、CAF>NFと遊走能が亢進している細胞ペアを抽出した。
２，１で適格となった3症例分のNF、CAFペアからそれぞれmRNAを抽出してmRNAマイクロアレイ解析を行った。結果から有意にCAF>NFとmRNA発現亢進しているイオンチャネルや膜輸送体を選出した。
３，２にて選出した候補をweb上のデータベースや過去の報告などより数個に絞りこみ、２のmRNAマイクロアレイ解析に使用したCAF、NFペアにてマイクロアレイ結果に対するバリデーションをRT-PCR法にて行った。さらにヒト線維芽細胞株を大腸癌細胞株と共培養すること（正常線維芽細胞株のCAF化）により前途のバリデーションを行い、分離培養細胞ペアを用いたマイクロアレイ解析と一致することを確認した。
４，標的遺伝子のsiRNAを用い、分離培養したCAFにおいてノックダウンが問題なくできることをRT-PCR法にて確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
腫瘍量が多い手術症例でのみ検体採取が可能であったため、ヒト組織からの分離培養セットを14症例まで増やすことにある程度時間を要し、そこからmRNA microarrayに使用する3症例分を選出する実験、ならびにmicroarray自体に時間を要したものの、microarray結果ならびにweb databaseや既報告を合わせた解析により数ヶの候補に絞ることが出来た。
また、fibroblastにおいてsiRNA transfectionが問題なく実施できることを確認できた。
fibroblastが上皮系細胞より生育スピードが緩徐であることも考慮すると、これまで概ね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
１，CAFにおいて候補遺伝子のsiRNA transfectionを行い、癌細胞と共培養（Boyden chamber法ならびにCAF上澄み液を使用）により癌細胞の遊走・浸潤能、増殖能、細胞周期、細胞死などの解析を行う。同様の解析を候補分子の阻害剤を用いて行う。
２，CAFにおいて候補遺伝子のsiRNA transfectionによる上澄み液中のサイトカインの変化についてサイトカインアレイを用いて解析する。同様の解析を候補分子の阻害剤を用いて行う。
３，CAFにおいて候補遺伝子のsiRNA transfectionを行い、癌細胞とのゲルフォームで3D共培養を行いヌードマウスへ皮下注射投与し、皮下腫瘍モデルを作成する。腫瘍の大きさ・重量・組織像などをコントロールと比較する。同様に候補分子の阻害剤を用いて解析を行う。
４，当科の有する大腸癌切除コホートを用い、候補タンパクの免疫染色を行い間質での発現程度をスコアリング化し、臨床病理学的因子や予後との相関を検討する。
これらを纏めて学会報告し、最終的に論文として投稿する予定である。
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