末梢代謝組織のリン酸化プロテオミクスより新たな生活習慣病治療ターゲットの探索

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K17770
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 佐藤 葵 新潟大学, 医学部, 技術補佐員 (10808752)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: Phos-tag対角線電気泳動法 / 生活習慣病

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、生活習慣病に関わる変動可能で機能的なリン酸化部位を明らかにし、新たな治療標的へと発展させるために、(1) 生体試料より得たタンパク質のリン酸化状態をPhos-tag対角線電気泳動法による評価系の確立、(2)生活習慣病の病態形成に関与する機能的なタンパク質のリン酸化状態の同定により、病態の予防・治療法を創出することを目的としている。
本年はPhos-tag対角線電気泳動法を用いたタンパク質のリン酸化状態の評価系確立のために、着目しているタンパク質FoxM1のリン酸化状態の異なるサンプルを用いて、Phos-tag対角線電気泳動後にPVDF膜へ転写、FoxM1抗体による検出を行った。転写因子FoxM1は膵β細胞の増殖に中心的な役割を果たすことが明らかになっている（Shirakawa J. et al. Cell Metab. 2017）。FoxM1は、MAPKやChk2、Cdkファミリーにより、複数個所リン酸化されることが報告されているが、各リン酸化部位がどのような細胞外刺激により変化するのか、また、どのリン酸化部位がFoxM1の核内移行や転写機能の活性化に関与するのかは不明な点が多く残っている。すると、核と細胞質分画、MAPKの阻害剤であるU0126添加によりFoxM1の泳動パターンに変化が見られた。しかしながら、Phos-tag対角線電気泳動の一次元目と二次元目で検出されるバンドのパターンに乖離がみられるなどの問題が発生した。一次元目と二次元目で検出されるバンドのパターンに乖離については、タンパク質の抽出方法により影響を受けることが明らかになった。
Phos-tag対角線電気泳動によりリン酸化状態の異なるタンパク質スポットを特定後にそのスポットを質量分析計で測定を行う予定であり、質量分析計にかけるためのサンプル調整方法や機器操作、解析方法を現在習得中である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

所属機関の変更により新たに研究環境のセットアップが必要となったため。

Strategy for Future Research Activity

今後はPhos-tag対角線電気泳動により、リン酸化状態の異なるスポットをCBB染色や銀染色で検出できるようにFoxM1抗体を用いて免疫沈降によりサンプルの濃縮を行う。また、抗体による濃縮の限界も想定されるので、FoxM1にこだわらず肥満や糖尿病などの病態により変化するリン酸化状態の異なるタンパク質をPhos-tag対角線電気泳動と質量分析の両方を組み合わせて網羅的に解析を行っていく。

Causes of Carryover

所属機関及び職務の変更により、自らの研究エフォートの割合が変化したため。
新たな環境においても、研究活動を行う環境が整いつつあるので、翌年度より研究活動を準備進め、必要な試薬・機器・消耗品等を購入していく。