肝細胞／ECMダブルインジェクションによる肝臓内肝組織構築

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K18186
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 白木川 奈菜 九州大学, 工学研究院, 助教 (90724386)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 再生医療 / 肝臓 / 細胞外マトリックス / 肝障害

Outline of Annual Research Achievements

肝臓移植医療において世界的なドナー不足であり、代替法として肝組織を新たに構築する肝再生医療が希求されている。本研究では、肝細胞の生着・増殖・機能発現に適した環境を設計するという発想のもと、肝臓内への肝細胞と肝臓由来細胞外マトリックス（Extracellular Matrix;ECM）のダブルインジェクションにより、低侵襲かつ迅速に肝組織を構築することを目的とする。肝組織内でゲル化する肝ECMを開発し、腸管血流の供給、増殖因子等の固定化、増殖スペースの確保、という肝細胞に適した微小環境を作製する。肝細胞／ECMをダブルインジェクションし、マウス・ラット肝臓の複数個所に肝組織を構築する。
1年目（2022年度）は肝細胞／ECMをダブルインジェクションし、肝臓内部でゲル化可能な肝ECM基材の開発を行った。I型コラーゲンゾル、または肝臓由来細胞外マトリックスとゲニピンの混合物を、中性化及び、肝臓内において37℃環境下静置によりゲルを形成することに成功した。さらに、ゼラチンとゲニピンを混合することにより、肝臓内における生体環境下でゲルを形成することに成功した。さらに、染色したマウス初代肝細胞をI型コラーゲンに包埋してインジェクションにより70％部分肝切除を施したマウスの肝臓に移植し、肝臓内部でゲルが形成され、ゲル内部に染色した肝細胞が見られた。
2年目（2023年度）は肝疾患患者の肝臓を再現するため、薬剤投与により肝硬変モデルマウスの作製を試みた。既往の報告をもとに薬剤の種類、濃度、投与のタイミングを検討し、肝細胞の損傷が認められ、血液成分からも肝障害が認められた。肝障害誘導状態のマウスの肝臓に対して、肝細胞／ECMのダブルインジェクションにより肝細胞を移植することに成功した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

2年目である2023年度は肝細胞／ECMダブルインジェクションによるマウス肝臓内における肝組織構築を予定していた。肝切除時や肝不全患者の体内においては肝細胞増殖因子の分泌が認められる。そのため、まずは再現性の高い手術により肝再生を誘導するモデルとして70%部分肝切除を施したマウスの肝臓内部における肝細胞／ECMダブルインジェクションによる細胞移植と組織構築を試みた。細胞の移植には成功したものの、70%部分肝切除を施すことで残った肝臓内に流入する血液の流速が上昇し、残った肝臓内における安定したゲルの形成や維持が困難であり、移植した肝細胞の増殖による肝組織構築には至らなかった。一方で、薬剤としてチオアセトアミドを用いた肝障害モデルマウスの作製に取り組んだ。1回の投与による急性肝不全誘導モデルと1カ月の継続投与による慢性肝不全モデルの作製を試みたが、いずれも肝不全の程度のコントロールが難しく、作製した肝不全モデルにおいて、十分な線維化は認められなかった。しかし、投与翌日においては肝不全の指標であるALT、AST、総ビリルビンの血中濃度の上昇が認められた。そこで、投与翌日に肝細胞／ECMダブルインジェクションによる肝細胞移植を試みたところ、本手法により肝臓内に肝細胞を移植することに成功した。
他方、本年度の半ばに自身の異動や出産があり、十分な実験時間の確保が難しかった。
以上のことより、やや遅れていると考える。

Strategy for Future Research Activity

2024年度は肝細胞移植後の体内における肝組織構築を目指す。肝障害（薬剤性肝硬変）モデルマウス・ラットを作製する。初代肝細胞もしくは肝前駆細胞を肝ECMゲルと複合し、肝臓内に移植して肝組織構築を試みる。肝臓の数箇所に肝細胞／ECMダブルインジェクションし、生体内における肝組織構築を検討する。移植後1～2週間程度まで肝臓内に作製した肝組織を回収する。免疫組織化学的評価から、形成肝組織サイズ、移植肝細胞の増殖（Ki67等）、組織 構造（接着因子、肝毛細胆管、肝細胞極性等）、機能発現（肝転写因子、アルブミン、CYP等）を評価し、肝組織形成の過程を明らかにする。
また、肝臓内での安定したゲル形成を目指し、ECMの取得方法を見直す。可溶化の際に使用するペプシンの濃度や可溶化にかける時間を検討することで、ゲルを形成しやすいECMの調整を試みる。
以上の検討を通して本研究が提唱する肝細胞／ECMダブルインジェクションによる迅速な肝組織構築法を開発し、得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行う。

Causes of Carryover

研究代表者の異動や出産があり、研究計画がずれ込んでしまった。次年度、本年度の研究の再現性を取るための実験や多少の追加実験を行う予定である。また、得られた成果を取りまとめ、発表する。