2022 Fiscal Year Research-status Report
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22K18381
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
日野原 邦彦 名古屋大学, 医学系研究科, 特任准教授 (50549467)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Keywords | がん免疫療法 / 薬剤耐性 / 発現型バーコード / １細胞RNAシーケンス / 進化軌跡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、がん免疫療法に対する耐性進化軌跡の解明に向けたがん細胞株移植モデルのバーコード化を行なった。複数のマウスがん細胞株を対象とし、レンチウイルスベースの発現型バーコードライブラリを低タイターにて感染させ、1細胞ごとに異なるバーコードを保持するがん細胞株を樹立した。これらのバルク細胞集団からDNAを抽出してバーコード領域をPCR増幅し、そのサンプルを次世代シーケンスにて解析したところ、それぞれの細胞株が数百から数千のバーコードによりラベルできていることがわかった。これは多様ながん細胞を追跡する上で十分な数のバーコードではあるものの、マウス移植後に生着するクローンがどの程度存在するかは未知である。そのため、これらの細胞株をマウス移植して生着させた後に得られた腫瘍組織のバーコード多様性を今後検証し、十分な数のがん細胞をin vivoで追跡し得るモデル細胞株の選別を行う必要がある。一方で、来年度以降に実施予定である１細胞データの取得を見据え、個々の細胞における発現バーコード情報を解析するパイプラインの準備も進めた。既存のpublicデータを用いてパイプラインの検証を進め、１細胞トランスクリプトームデータと共に取得される発現バーコード情報を解析するパイプラインを構築した。実際のデータ取得は10xChromiumにて実施予定であるため、これらのバーコード情報をCell Ranger上にてvisualizeする方法論も併せて開発した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
がん免疫療法に対する耐性化実験モデルとして、養子免疫療法や免疫チェックポイント阻害剤投与のモデルとなる複数のマウスがん細胞株を発現バーコード化し、十分量のクローンを追跡し得る細胞株モデルの構築を終えた。これらのバーコードをバルク細胞のDNAからPCR増幅して次世代シーケンスに供し、そのバルクデータを解析する方法論も構築した。さらに来年度以降に実施予定である１細胞RNA-seq解析を見据え、個々の細胞に発現するバーコード情報を１細胞レベルでトランスクリプトーム情報と共に取得するためのパイプラインも構築した。このように、本年度は当初の計画通りバーコード化細胞株モデルの樹立とバーコード解析系の確立を終えることができた。現在これらの細胞株のin vivoにおける生着率を検証するためのマウス移植実験の準備を進めており、来年度以降の研究の実施に影響する大きな問題等も発生していない。以上のように、当初の研究計画はおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
がん免疫療法に対する薬剤耐性進化軌跡を１細胞の遺伝子発現レベルで捉えるため、まずはモデルとなる細胞株の選別を進めていく。In vitroでは十分量のクローンを追跡可能ながん細胞株を複数樹立することができたが、マウス体内（in vivo）では移植直後から生着できるクローンと生着できないクローンに別れることが予想される。大幅にクローン数が減ると追跡実験の意味をなさなくなってしまうため、相当数のクローンが生着する細胞株を選別する必要がある。また、治療過程における個々のクローン運命を追跡する上ではがん細胞が長期に渡りマウス体内に留まる必要があるため、来年度はじめに実施する生着率実験は30-60日程度の期間を設けて時系列にサンプル採取を行う予定である。また少なくとも数百程度のクローン追跡を可能とするために必要な移植細胞数や移植実験系（PBS or Matrigelなど）についても併せて条件の最適化を進める。また、１細胞トランスクリプトームデータからバーコード情報を得て解析するためのパイプラインは作成を終えたが、実際にそれぞれのタイムポイントで得られる数千細胞のバーコードデータからどのように細胞運命をつなげて解析するかについても具体的な解析系を構築していく必要がある。この点についても過去論文を参考にしつつ来年度以降で順次解析系の構築を進めていくことを予定している。現在はマウス移植実験の準備を進めているが、来年度はじめからがん免疫療法に対する耐性進化軌跡の追跡に適したモデル細胞株を選別し、その後に１細胞解析へと歩を進める予定である。
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