精密移植＆フィッティング技術により挑戦する金属表面滑走モータータンパク質創出

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K18911
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 中澤 光 東北大学, 工学研究科, 准教授 (40584991)
• Project Period (FY): 2022-06-30 – 2025-03-31
• Keywords: ペプチド / キネシン

Outline of Annual Research Achievements

キネシンはモータータンパク質として知られており、「走る」という動的性質からナノスケールのアクチュエーターとして期待されており、最近ではアメーバ状ナノロボットや繊維状ナノロボットの駆動力として使われている。キネシンのマイクロチューブリン上しか移動できないという使用の制限を解決するために、本申請は、マイクロチューブリン表面以外の無機材料表面を走るキネシンタンパク質の開発に挑戦した。キネシンは、ループL11とループL12によって微小管の表面に繰り返し存在するそれぞれの相互作用部分とATP依存で交互に結合することによって、走っていることがわかってきた。結合は物理吸着であることから、申請者は「走る」ためには、キネシンの動く相互作用部位と、結合対象の「8nm」の幅で繰り返す相互作用部位が重要と考えた。本申請では①キネシンの相互作用ループへの結合ペプチドの移植および②相互作用部位を一定の間隔で配置したナノマテリアル構造体の作製を行い、無機材料表面を走るキネシンタンパク質の開発にチャレンジする。
当該年度はC末端ビオチン化したNeurospora Crassa 由来のキネシンをすでに大腸菌を宿主として大量発現させていたが、調製に難航した。大腸菌にてより発現量の多いキネシンが見つかったためそれを用いた方が今後の実験が円滑に進むと考え、新たに、タグ融合遺伝子構築を行った。このキネシンを用いて所属する研究室でペプチド移植を進めていくこととする。移植に関してはまだ行っていないが、予定通り金結合ペプチドおよび酸化亜鉛結合ペプチド）の長さを調節し、キネシンのループL11とループL12それぞれに移植、あるいはシリカ結合ペプチドを両ループに移植することを想定して遺伝子を設計した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ペプチド移植の鋳型として、既存のNeurospora Crassa 由来キネシンの発現を行ったところ、タンパク質の調整に難航した。そこでより大腸菌において発現しやすい別のキネシンを用いてキネシンを生産させる方針に変更し、実行した。大腸菌におけるタンパク質発現に成功し、これから、ペプチド移植キネシンを作製する。また、ナノ粒子作製は着手できていない。やや遅れてはいるが戦略変更で大量にキネシンを供給できるように改善できたため、今後の研究加速が期待できる。

Strategy for Future Research Activity

令和5年度は、大量発現型のキネシンが獲得できたため、安定したキネシン調製系を得た。このキネシンを用いて、まずは、予定通り金結合ペプチドおよび酸化亜鉛結合ペプチド）の長さを調節し、キネシンのループL11とループL12のそれぞれに移植、あるいはシリカ結合ペプチドを両ループに移植する。移植後は、ZnOなどの金属プレートへの結合をQD655量子ドット修飾キネシンの蛍光を指標に観察する。
結合がみられた場合、令和6年度は、8nmの細孔のマテリアルを準備し、金属表面上を走ることをAFMなどによって観察する。同時に、片方のループにランダム変異を導入することによって最適化したキネシンを取得する。

Causes of Carryover

試薬に使用する予定であったが、設計によって使用する試薬が異なるため、設計変更を余儀なくされたため、無駄にならないように決済を遅らせた。予定通り試薬に使用予定である。