2022 Fiscal Year Research-status Report
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22K18948
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
森垣 憲一 神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 准教授 (10358179)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2024-03-31
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| Keywords | 疾患マーカー / 人工膜 / ナノ空間 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、生体膜を模倣した人工膜と、厚さが数十ナノメートルのナノ空間を組み合わせて疾患関連生体分子（疾患マーカー）を1分子計測する技術を開発する。そのために2022年度は、パターン化人工膜とナノ空間の作製技術、パターン化人工膜への抗体の固定化技術を開発した。
パターン化人工膜は、光重合性リン脂質を光リソグラフィー技術でパターン化重合したポリマー脂質膜に、生体由来の脂質膜（生体脂質膜）を組み込んで作製した。一方、ナノ空間は、ポリマー脂質膜と高分子エラストマー（PDMS）を厚さが均一な接着層（高分子被覆シリカ微粒子）により接着することで作製した。平均粒径100 nmのシリカ微粒子表面に、2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC)と2-aminoethyl methacrylate (AEMA)からなる鎖長の均一な高分子ブラシを原子移動ラジカル重合法で形成した。この高分子被覆シリカ微粒子を接着層としてポリマー脂質膜とPDMSとを接着して厚さが100 nm程度のナノ空間を形成した。ナノ空間の形成は、脂質膜に結合した標的分子の側方拡散による選択的輸送により評価した。パターン化人工膜への抗体の固定化技術は、抗体分子を酵素反応および還元反応によって分解することで抗原認識部位 (Fab’)を取り出し、Fab’に含まれるシステイン基にマレイミド基を介してDibenzylcyclooctyne (DOCO)基を結合した。そして、生体脂質膜内に予め5mol%導入したアジド基含有脂質にFab’-DBCOを選択的に結合させることで、生体脂質膜に高効率で抗原認識部位を結合した。Fab’は脂質膜において2次元拡散することができた。
今後、抗原認識部位を提示した生体脂質膜表面において疾患マーカーのサンドイッチ検出を行いナノ空間における高感度な検出を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、生体膜を模倣した人工膜と、厚さが数十ナノメートルのナノ空間を組み合わせて疾患関連生体分子（疾患マーカー）を1分子計測する技術を開発することを目的としている。2022度は、パターン化人工膜とナノ空間の作製技術、パターン化人工膜への抗体の固定化技術を開発した。
パターン化人工膜は、光重合性リン脂質を光リソグラフィー技術でパターン化重合したポリマー脂質膜に、生体由来の脂質膜（生体脂質膜）を組み込んで作製した。特に、光重合性脂質の重合効率、光リソグラフィー技術などを改良することで、均一かつ明確なパターンを持ったポリマー脂質膜を作製することができた。一方、ナノ空間は、ポリマー脂質膜と高分子エラストマー（PDMS）を厚さが均一な接着層（高分子被覆シリカ微粒子）により接着することで作製した。シリカ微粒子表面に鎖長の均一な高分子ブラシを原子移動ラジカル重合法で形成し、これを接着層としてポリマー脂質膜とPDMSとを接着することで厚さが100 nm程度のナノ空間を形成した。ポリマー脂質膜とPDMSとを接着するプロセスを改良することで、ナノ空間を再現性良く安定に形成することに成功した。また、パターン化人工膜への抗体の固定化技術として、抗体分子の抗原認識部位 (Fab’)と脂質分子をDibenzylcyclooctyne (DOCO)基とアジド基との選択的結合（クリック反応）により結合することに成功した。生体脂質膜に高密度で抗原認識部位を結合し、Fab’は脂質膜において2次元拡散することができた。この技術は今後、抗原認識部位を提示した生体脂質膜表面において疾患マーカーのサンドイッチ検出を行いさらにナノ空間において疾患マーカーの1分子検出を行うための基盤となるものである。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究は、生体膜を模倣した人工膜と、厚さが数十ナノメートルのナノ空間を組み合わせて疾患関連生体分子（疾患マーカー）を1分子計測する技術を開発することを目的としている。2022年度には、パターン化人工膜とナノ空間の作製技術、パターン化人工膜への抗体の固定化技術を開発した。2023年度はこの実績にもとづいて生体脂質膜表面において疾患マーカーのサンドイッチ検出、ナノ空間において疾患マーカーの1分子検出技術を開発する。
モデル疾患マーカーとして前立腺ガンマーカー(PSA)を用い、PSAを認識する２種類の抗体に脂質または蛍光色素を結合した捕捉抗体と標識抗体を作製する。捕捉抗体は昨年度に開発したクリック反応を用いて生体脂質膜表面に固定する。PSA分子を生体脂質膜の表面に捕捉して複合体を形成する（サンドイッチ法）。複合体は膜分子の２次元拡散でナノ空間へ導入され、膜に結合できない夾雑分子の混入は抑制されると予想される。ナノ空間において膜表面を2次元拡散するPSA（非標識）を1分子蛍光観察で検出する。モデル夾雑分子（ヒト血清アルブミン）が高濃度に存在する条件でPSAの1分子計測を行い、検出下限、正確性、迅速性を評価する。ナノ空間は、厚さが極めて小さいため、夾雑分子混入と背景蛍光を最小限に抑制し、S/N比を飛躍的に向上できる。膜に結合した分子と膜に結合していない分子の拡散速度は大きく異なるため、２次元拡散する分子を追跡することで、特異的に結合した標的分子と、非特異的に混入した夾雑分子を区別できるものと期待される。
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| Causes of Carryover |
ナノ空間での疾患マーカー検出のためには、顕微鏡光源を改良してより均一な照明を実現することが必要と判明したため、2022年度予算の一部を2023年度予算と合わせて顕微鏡照明用LEDを取得する予定である。
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Research Products
(13 results)
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[Journal Article] Enhancing the spectral range of plant and bacterial Light-Harvesting pigment-protein complexes with various synthetic chromophores incorporated into lipid vesicles2022
Author(s)
Hancock, A. M., Swainsbury, D. J. K., Meredith, S. A., Morigaki, K., Hunter, C. N., Adams, P. G.
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Journal Title
J. Photochem. Photobiol., B
Volume: 237
Pages: 112585
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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