2022 Fiscal Year Research-status Report
piRNA and spermatogenesis on reproductive isolation
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22K19236
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
杉山 文博 筑波大学, 医学医療系, 教授 (90226481)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
村田 知弥 筑波大学, 医学医療系, 助教 (60713485)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2024-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / small RNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、雑種不稔マウスモデルを用い、連続する精子形成でのpiRNAを含む転写物のダイナミクスな発現様式をゲノムワイドに明らかにし、生殖隔離における雄性減数分裂停止機構の解明に挑戦することを目的としている。
2022年度は、①候補piRNA群をランダムもしくは網羅的に破壊することが可能なsgRNAベクターライブラリの開発と②生殖細胞のみで蛍光タンパクEGFPとゲノム編集エフェクターの両者を発現するマウスの開発、を実施した。
①候補piRNA群をランダムもしくは網羅的に破壊することが可能なsgRNAベクターライブラリの開発では各候補piRNAにそれぞれ対応した17種類のsgRNA発現ベクターを構築した。これらのベクターにはpiRNAに対応するsgRNAだけではなく、切断することで蛍光タンパクが発現する切断レポーターカセットも搭載した。実際に生殖細胞でゲノム編集を生じさせる前に、各sgRNAの切断活性をマウス胚性幹細胞で評価した。切断をレポートする蛍光を発現する細胞のみを分取して、それらをシングルセルクローニングし、ゲノムDNAを抽出した。それらをクローンにおける変異をPCRもしくはサンガーシークエンスで確認したところ、sgRNA間で活性に差があったものの全てのsgRNAが標的サイトに変異誘導が可能であった。
②生殖細胞のみで蛍光タンパクEGFPとゲノム編集エフェクターの両者を発現するマウスの開発では、生殖細胞特異的に発現することが知られているマウス内在性遺伝子の下流に、IRESでつないだEGFP遺伝子とゲノム編集エフェクター遺伝子を受精卵ゲノム編集でノックインした。ノックインが確認されたファウンダーマウスにおいて、生殖細胞でEGFPが発現することが確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定通りに、sgRNAベクターライブラリの構築が完了し、その活性は少なくともin vitroレベルでは確認できている。
生殖細胞をモニターでき、かつ、ゲノム編集エフェクターを発現する新規の遺伝子改変マウスの確立にも成功した。
以上の理由からおおむね順調に進展したと判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2022年度に構築したsgRNAライブラリを単一もしくはミックスし、生殖細胞でのみ蛍光タンパクEGFPとゲノム編集エフェクターの両者を発現するマウスに導入する。そこで得られたマウスよりEGFPを発現する細胞を分取し、RNA-Seqにて発現プロファイルを明らかにするとともに病理学的検査で表現型を確認することで生殖不全に関与するpiRNAの混乱を特定することを目指す。
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Research Products
(1 results)
