2023 Fiscal Year Annual Research Report
体細胞におけるコヒーシンの異所性発現による減数分裂模倣系の構築
| Project/Area Number |
22K19248
|
|---|
| Research Institution | Kobe University |
|---|
Principal Investigator |
李 智博 神戸大学, 農学研究科, 准教授 (50372660)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2024-03-31
|
| Keywords | 減数分裂 / 生殖細胞 / 配偶子 / コヒーシン / 体細胞 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，減数分裂特異的コヒーシンサブユニットの異所性発現により，体細胞において相同染色体の連結を促す減数分裂模倣系の構築を目的としている。そのため，Tet-Onシステムを利用して，市販のNIH3T3 Tet-On 3G Cell Lineに，減数分裂特異的コヒーシンサブユニットのcDNAを挿入したpTRE3G-IRESベクターを導入し，ドキシサイクリン(Dox)添加による発現誘導を行うことを試みた。減数分裂特異的なコヒーシンサブユニットはRAD21L, REC8, STAG3, SMC1betaの４種類存在するが，そのうちのSTAG3はRAD21LとREC8の核内移行に必要なため，RAD21LとREC8を発現する際には，STAG3の同時発現も行う必要がある。しかし，購入したStag3のcDNAをシークエンス解析で調べた結果６箇所のミスセンス変異が見つかったため，まずその変異をデータベース上に記載された塩基配列にMutagenesis kitによって修正した。そのようにして構築したRAD21L/STAG3およびREC8/STAG3を発現するコンストラクトをNIH3T3 Tet-On 3G Cell Lineの導入し，安定発現細胞株を得るために薬剤選択培地によりスクリーニングを行い，それぞれ8個と12個の細胞コロニーが得られた。得られた細胞において，Doxによる遺伝子発現を試みた結果，REC8については数個の細胞クローンで発現が確認できたが，RAD2LとSTAG3については発現が確認できなかった。その原因として，ミスセンス変異を6回修正する過程でベクター内の他の箇所に変異が起きたことと，IRES後に挿入した遺伝子の発現量は極端に低くなるとも報告されているので検出感度以下の発現しかしていないことの２点が考えられる。
|
