2023 Fiscal Year Research-status Report
In situ実時間追跡による細胞内タンパク質結晶化メカニズムの解明
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22K19266
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
安部 聡 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (40508595)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
梶谷 孝 東京工業大学, オープンファシリティセンター, 主任技術専門員 (20469927)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Keywords | 細部内タンパク質結晶 / X線小角散乱 / X線回折 / 結晶化メカニズム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、細胞内でタンパク質が自発的に結晶化し、免疫活性化や毒素、ウイルスの保存、固体触媒など、様々な機能を発現することが明らかとなってきた。しか し、多様な機能の要となる結晶化過程は依然として不明であり、細胞内タンパク質結晶の全容を理解する上で長年の課題となっている。そこで、本研究では、結 晶化初期過程のオリゴマー形成からサブマイクロ結晶に至るまで、無秩序な集合体から秩序構造への動的な変化を微結晶X線構造解析とX線小角散乱法(SAXS)に よって直接追跡し、細胞内結晶化の全容を解明する。
昨年度は、細胞内で結晶を形成する「多角体」と「CipA」を用いて大腸菌での結晶化とその構造解析を行った。今年度は、大腸菌で結晶化する「多角体」を用いて、X線小角散乱の時間追跡により結晶化機構の追跡を行った。多角体を大腸菌内で30℃で発現し、SAXS測定を行うと発現開始後2時間後からわずかに結晶性を示すブラッグピークが観察された。このブラックピークは、結晶が成長した後のピークと同じq値に見られることから結晶形成の初期から同様のパッキングで結晶化されていることが示された。また、1時間発現したサンプルでは、ブロードの散乱ピークが観測され、結晶前駆体の存在を示唆している。一方で、37℃でタンパク質を発現した場合では、凝集構造はみられたもののこのような散乱ピークは観測できないため、30℃合成でみられた散乱ピークはランダムな凝集体ではなく結晶になる中間構造の存在を示唆している。したがって、多角体の結晶化では発現開始後1時間で特異な集合構造を形成し、その後結晶核を形成し成長すると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、昨年度の結果をもとにX線小角散乱により結晶化追跡を行い、結晶性を示す前に集合構造を示すことを示唆する結果が得られた。今まで細胞内での結晶化メカニズムは明らかになっていないため、メカニズム解明に近づけた。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は、多角体だけではくCipAのSAXS の時間追跡と結晶形成に重要だと思われる変異体の合成を行い、これらの結晶化とその解析を進める。さらなる測定により結晶化追跡も進める予定である。
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| Causes of Carryover |
令和5年度は、少量での結晶合成が多く消耗品にかかる費用がすくなかったことと、結晶化メカニズムを明らかにするために新しい測定を令和6年度に行うために研究期間を延長したため。
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