2023 Fiscal Year Research-status Report
脂質ラフトにおける新型コロナウイルスの侵入機構の解明
| Project/Area Number |
22K19301
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
|---|
Principal Investigator |
笠原 浩二 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基盤技術支援センター, 研究員 (60250213)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小松谷 啓介 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 研究員 (30795620)
菊池 紀仁 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 研究員 (30883714)
平林 哲也 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 主席研究員 (90345025)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
|
| Keywords | 新型コロナウイルス / 脂質ラフト / 侵入機構 / ガングリオシド |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
SARS-CoV-2 Sタンパク質には宿主受容体であるACE2と結合する領域RBD（319-537)が存在することが知られているが、Biacoreを用いた表面プラズモン共鳴解析により、N末端側領域であるNTD(13-303)がガングリオシドGM1と強く結合することを見出した。多くのウイルスはスフィンゴ脂質とコレステロールに富んだ脂質ラフトを介して細胞内に侵入することが知られている。このことから、スフィンゴ脂質の一種であるガングリオシドGM1と結合することで脂質ラフトを介するエンドサイトーシス経路によって細胞に侵入する可能性が考えられた。
そこで脂質ラフトがSARS-CoV-2の感染に必要不可欠であるかを、ACE2発現HEK293T細胞とSARS-CoV-2 Sタンパク質発現疑似ウイルスを用いて確認実験を行った。その結果、メチルβシクロデキストリンによる脂質ラフト破壊により、疑似ウイルスの感染を抑制することが確認された。さらに、ガングリオシドGM1に強く結合するコレラトキシンB subunit (CTxB)を用いて、あらかじめガングリオシドGM1をブロックしてGM1との結合を阻害すると、疑似ウイルスの感染が抑制された。
さらに、CRISPR-Cas9法によりガングリオシド生合成系の初発酵素GlcCer合成酵素(UGCG)を欠損させ、ガングリオシドGM1欠損細胞による感染抑制効果を検討した結果、UGCG欠損株で疑似ウイルスの感染が抑制され、UGCC欠損株に外からガングリオシドGM1を添加すると、疑似ウイルスの感染がレスキューされた。これらの結果により、ガングリオシドGM1が共受容体として機能していることが考えられる。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
SARS-CoV-2の宿主受容体であるACE2を安定発現させたACE2発現HEK293T細胞に対してSARS-CoV-2 Sタンパク質発現疑似ウイルスを感染させる実験系を用いることにより、安定した実験データーを出すことができた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
これまでにSARS-CoV-2 Sタンパク質発現疑似ウイルスの感染系を用いて、充分な感染には宿主細胞のACE2だけではなくガングリオシドGM1も必要であることを示すことができた。よって今後は、SARS-CoV-2各種株（武漢株、デルタ株、オミクロン株）の宿主細胞（VeroE6、VeroE6/TMPRSS2、ACE2発現HEK293T）への感染にもガングリオシドGM1が必要であるかどうか否かを調査する。
具体的には、コレラトキシンB subunit (CTxB)前処理によるGM1ブロックの感染阻害効果とUGCG欠損株への感染効率を、武漢株、デルタ株とオミクロン株を用いて各種宿主細胞で比較することにより、ガングリオシドGM1がエンドサイトーシス経路による細胞内侵入に関わっている可能性を検証する。
|
| Causes of Carryover |
2023年度に行ったガングリオシドGM1欠損細胞調製のためのゲノム編集作業が予定よりも早く進み、予算を抑えることができたため、次年度使用が生じた未使用額は、2024年度のガングリオシドGM1を介するエンドサイトーシス経路による感染を示すための解析に使用する予定である。
|
