2022 Fiscal Year Research-status Report

一酸化窒素によるエピジェネティクス依存的誘導遺伝子のデータベース構築

Research Project

Project/Area Number	22K19380
Research Institution	Okayama University
Principal Investigator	上原孝岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (00261321)
Project Period (FY)	2022-06-30 – 2024-03-31
Keywords	一酸化窒素 / エピゲノム / DNAメチル化 / 誘導遺伝子
Outline of Annual Research Achievements	申請者は一酸化窒素(NO)がエピゲノムに重要なDNAメチル基転移酵素（DNMT）をS-ニトロシル化修飾し，酵素活性を阻害すること，それに伴うゲノムDNA脱メチル化が亢進し，遺伝子誘導が惹起されることを見出した．興味深いことに，RNA-seq解析によって，NO刺激に伴って発現レベルが変化する遺伝子数は決して少なく無いことが判明した．これにより，エピジェネティックに調節を受けている遺伝子が細胞種毎に存在することが示唆された．そこで，ヒト肺胞基底上皮腺がん由来細胞株A549，ヒト胎児腎臓上皮細胞由来細胞株HEK293，ヒト胚芽腫由来細胞株HepG2，ヒト結腸上皮腺がん由来細胞株Sw48，ヒト胃粘膜上皮がん細胞株AGSに対して，NOドナーを作用させ，トランスクリプトーム解析を行い，誘導遺伝子のプロファイリングを試みた．その結果，NOによって発現が変動する遺伝子（Differentially Expressed Genes: DEGs）（p<0.01）を各細胞株毎に同定することができた．つぎに，それらに機能的な共通性があるか否かをエンリッチメント解析したところ，全ての細胞で共通したものは存在しなかった．このことから，NOが発現誘導する遺伝子は，各細胞によって異なることが示唆された．そこで，NOによる組織特異的な遺伝子の発現の有無に関して，由来組織機能に着目してDEGsのプロファイリングを行ったところ，がんとの関連が強く示唆されたDEGは各細胞株において一定数検出されたが，相関性は認められなかった．加えて，組織由来の遺伝子も含まれていたものの，高発現遺伝子は体内の多くの組織でユビキタスに発現しているものであった．
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 異なる組織由来の５種類の細胞株を用いて，NO曝露による誘導遺伝子のプロファイリングを行った．詳細なデータ解析によって，がん化された細胞間では，NO曝露によって共通の誘導遺伝子は検出されなかった．一方で，複数の細胞で共通する遺伝子は特定することができた．この中，組織特異的な遺伝子やがん（増殖）に関わる遺伝子の発現が上昇することは無かった．NOはDNMTの酵素活性を阻害することで，脱メチル化を惹起して，遺伝子を誘導させるが，株化した培養細胞を対象とした実験では，組織特異的な遺伝子は多くは検出されず，また，他の臓器に由来するものも同様であることを明らかにすることができた．このような結果はこれまでに提示されておらず，初年度に実施して得た情報をプロファイリングすることができた．
Strategy for Future Research Activity	初期的な検討では，マウス初代培養神経細胞では，他の臓器特異的な遺伝子の誘導が観察され，細胞死に連関している可能性が見出されている．以上の結果から，NOによる誘導遺伝子を解析するためには，株化された培養細胞よりも，種々のヒト正常細胞を使用した方が，体内での現象を再現できるのではと結論づけた．そこで，気道上皮細胞，大脳皮質神経細胞・グリア細胞，大動脈外膜線維芽細胞，大動脈平滑筋細胞，冠状動脈内皮細胞などに対して，NO曝露で変動する遺伝子の特定を進めることとした．RNA-seq解析後に，エンリッチメント解析やGO解析を行ってプロファイリングするとともに，興味深い遺伝子に関しては，DNMTニトロシル化阻害薬DBICの効果も併せて検討し，誘導機構についても迫る予定である．
Causes of Carryover	研究を進める際に，NOによってどのような遺伝子が誘導されるのか，細胞腫毎に発現遺伝子は異なるか，共通性や選択性があるか，などの疑問があった．本年度，５種の株化細胞で研究を行ったところ，上記のような結果が得られた．複数回に渡りRNA-seq解析し，その情報を時間をかけて精査することが重要であると考え，エンリッチメント解析などで詳細に検討した．ここで明確な差や新たな結論が得られた際には，さらに，細胞を増やして検討する予定であったが，実際には，興味深い結果ではあったが，先に進めるには，実験条件を変えることが必要であるとの結論となった．初期的な検討から，初代培養細胞や正常細胞を使用することで，正確で，予想しないような遺伝子が誘導されていることがわかった．従って，次年度は高価ではあるが，種々のヒト正常細胞を購入して，NO曝露による誘導遺伝子を特定することとした．また，その結果が得られ次第，学会発表や原著論文投稿する予定である．