2022 Fiscal Year Research-status Report
The Role of Genomic Imprinting in the Brain
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22K19406
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
山口 新平 東邦大学, 理学部, 講師 (80740795)
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2022-06-30 – 2025-03-31
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| Keywords | インプリンティング / キメラ / 発生工学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
卵が受精することなく発生を開始する単為発生は、高等生物を含む多くの種で確認されているが、哺乳類では胎生致死となり、全く発生しない。これは、哺乳類では父親由来と母親由来の染色体が異なる役割を果たしており、両方が揃うことが正常な発生に不可欠なためであり、片方の染色体からのみ発現するインプリンティング遺伝子が存在するためである。インプリンティング遺伝子の多くは、脳や胎盤で高発現していることから、インプリンティングが胎盤と発達した脳という哺乳類の主徴を獲得する上で重要な役割を果たしたことが示唆されている。しかし、脳においてインプリンティングがどのような働きを担っているのかという生理機能はほとんどわかっていない。そこで申請者は、単為発生胚の致死性の表現型を、キメラ胚補完法でレスキューすることに着想した。さらに、CRISPRによる遺伝子破壊胚をホストとして用いることで、特定の組織の細胞を単為発生胚由来の細胞に置換することができるのではないかと考えた。
本年度はまず、小脳と中脳の発生に必須のWnt1を標的として選んだ。Wnt1を欠損するマウス胚では中脳と小脳の発生が強く阻害された。一方、未受精卵を活性化して作製した雌性単為発生胚と凝集して作製したキメラ胚ではこの異常がレスキューされていた。このマウスからはFACSを用いることで単為発生胚由来細胞を回収して遺伝子発現解析を行ったところ、既知のインプリンティング遺伝子に加えて、多くの未知のインプリンティング遺伝子候補が同定できた。個々の細胞における遺伝子発現をさらに解析すると同時に分化異常を詳細に解析するために単一核RNAシークエンシングに着手し、そのサンプル準備をほぼ完了することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
単為発生胚による脳の置換実験系を確立し、高効率キメラと、キメラ胚における表現型のレスキューが再現性良く確認できた。さらに、バルクでの遺伝子発現解析も完了し、新規のインプリンティング遺伝子候補も多数同定できた。一方で、研究代表者の研究機関の移動のために研究の進捗が停止する期間があった。後半には単為発生胚由来神経細胞の表現型解析のための神経細胞の単離、培養実験系も確立でき、単一核RNAシークエンシングの準備も整った。次年度にむけてインプリンティングの細胞分化と遺伝子発現制御における役割を明らかにする準備が整った。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は単一核RNAシークエンシングによる遺伝子発現解析と、培養神経細胞の表現型解析、および組織学的異常の解析を実施する。これらの解析を通じて単為発生胚に由来する神経細胞がどのような遺伝子プロファイルをもち、どのような細胞生物学的特性、特に増殖と分化、に異常が生じているのかを明らかにする。これらの結果に基づいて、生体内の脳の発生において重要な機能を果たしているインプリンティング遺伝子を絞り込む。これらの実験が順調に進んだ場合には、単為発生胚の脳置換マウスを出生させ、出生後の表現型解析に着手する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由：研究代表者の研究機関の移動に伴い、研究を実施できず停止する期間が半年程度あったために、一部の実験を計画通りに実施することができなかった。
次年度使用額：3,376,445円（物品費：2,000,000円、旅費：200,000円、人件費・謝金：0円、その他：1,176,445円）
使用計画：物品費は実験動物購入費用、生化学、細胞生物学実験試薬、抗体の購入などに用いる。旅費は情報収集と研究発表のための学会参加費用などに用いる。また、その他の経費はシークエンシング解析の受託解析費、実験動物の維持費用などに加えて機器の故障修理などでの用途を想定している。
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Research Products
(3 results)
